Rosa, Álvarez-Parrilla, and García-Fajardo: Identificación de compuestos fenólicos en extractos de almendra (Prunus dulcis) y nuez pecana (Carya illinoinensis) mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS)



Introducción

La almendra y nuez pecana son los frutos del Almendro (Prunus dulcis) y del Pecano (Caryaillinoinensis) respectivamente. Son clasificadas como frutos secos, o frutos oleaginosos por su bajo contenido de agua y elevado contenido de aceite, en comparación con las frutas convencionales, por ejemplo, la manzana. Han sido consumidas como alimento por los seres humanos desde épocas muy remotas por su alto valor nutritivo (Alasalvar & Shahidi, 2008). Hace algunas décadas, su consumo era poco recomendado por médicos y profesionales de la nutrición debido a su alto contenido lipídico, sin embargo, multitud de estudios han demostrado que el consumo habitual de frutos secos incluyendo nueces, almendras avellanas y cacahuates (alrededor de 30-40 g diarios), está asociado con una menor mortalidad por enfermedades del corazón y otros padecimientos como los crónico degenerativos, incluso se le relaciona con una mayor esperanza de vida (Aune et al., 2016); por lo que actualmente son recomendadas por diversas asociaciones americanas y europeas para la protección de la salud (Chang, Alasalvar, Bolling & Shahidi, 2016).

Por su alto contenido de ácidos grasos insaturados y tocoferoles (formas de la vitamina E), las propiedades benéficas de las nueces se atribuyeron sobre todo a la porción lipídica de estos alimentos; sin embargo, los frutos secos también son ricos en antioxidantes polares (compuestos fenólicos, CF) y micronutrientes, por lo que es muy probable que el mecanismo de protección sea dependiente de los efectos sinérgicos entre los numerosos componentes bioactivos de estos alimentos (Chang, Alasalvar, Bolling & Shahidi, 2016). Entre los frutos secos, las almendras destacan por su alto contenido de α-tocoferol (la forma más bioactiva de la vitamina E) y son los frutos secos más producidos y consumidos a nivel mundial (Chang, Alasalvar, Bolling & Shahidi., 2016). La nuez pecana posee el mayor contenido de CF y una muy elevada capacidad antioxidante. A nivel mundial su producción y consumo no son muy altos, estando en el 5° y 6° lugar entre los frutos secos, pero a nivel nacional, es un producto sumamente importante, ya que México es el primer productor y exportador (Álvarez-Parrilla, Urrea-López & de la Rosa, 2018). Por su menor presencia mundial, la nuez pecana no ha sido tan estudiada como la almendra, sin embargo, se ha reportado que su perfil de CF es sumamente complejo, ya que es rico en taninos condensados e hidrolizables (Robbins, Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014). En cuanto a la identidad de los CF de la almendra, también contiene taninos condensados, pero es más rica en flavonoides monoméricos (Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007).

Varios trabajos que han caracterizado el perfil de los CF de nuez pecana y almendra demuestran que éste puede variar en respuesta a factores intrínsecos de la muestra, como por ejemplo: la variedad, región y condiciones de cultivo, tratamiento y almacenamiento poscosecha, así como por condiciones experimentales de extracción. Por otra parte, el uso cada vez más habitual de nuevas herramientas analíticas, como la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) permite identificar un mayor número de compuestos con menor manipulación de los extractos, que da una idea más clara de las estructuras nativas de los compuestos presentes en las plantas silvestres y en especies vegetales cultivadas. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar el perfil de los CF, mediante HPLC-MS/MS de dos tipos de extractos de nuez pecana y almendra, un extracto etanólico y uno acetónico. El primero es el disolvente utilizado preferentemente para la extracción de los CF monoméricos, mientras que el segundo es utilizado para la extracción de compuestos poliméricos (de la Rosa, Álvarez-Parrilla & Shahidi, 2011). En lo que respecta a un perfil fenólico detallado, se compara el efecto de la naturaleza del solvente frente al de las diferencias naturales entre dos diferentes especies de fruto seco. Asimismo, se identifica y se caracterizan los patrones de fragmentación de los compuestos bioactivos presentes en los extractos crudos de ambas especies con el objeto de profundizar en el conocimiento de este importante grupo de alimentos.

Los CF presentes en productos alimenticios son reconocidos por su actividad antioxidante, que puede tener efectos positivos en la conservación del alimento, así como en la salud del consumidor. Adicionalmente, se ha demostrado que los CF presentan múltiples actividades biológicas, incluyendo la regulación de la expresión de genes, la inhibición de enzimas y la modulación de la microbiota entérica (Sauceda et al., 2018; Lamuel-Raventos & St. Onge, 2017). Por este motivo, es importante conocer el perfil y contenido de los CF en los alimentos que consumimos, sin embargo, la gran diversidad estructural de los mismos dificulta esta labor. Existen más de 8,000 CF en el reino vegetal, la mayoría de los cuales se pueden agrupar en las categorías de flavonoides y ácidos fenólicos. Sin embargo, éstos rara vez se encuentran en la naturaleza en forma de compuestos libres, sino que más bien se presentan glicosilados (generalmente unidos a mono o disacáridos) esterificados con ácidos orgánicos, o incluso ligados con macromoléculas o formando complejas estructuras poliméricas.

La identificación de los CF individuales, se ha realizado principalmente por técnicas de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC); sin embargo, estos análisis se han visto limitados en gran parte por la falta de estándares de las formas nativas (glicosiladas, esterificadas, etc) de estos compuestos. Actualmente, el uso de detectores de masas acoplados a equipos de HPLC, aunado al desarrollo de técnicas más eficientes de cromatografía de ultra alta eficiencia (UPLC) ha permitido mejorar la capacidad de detección e identificación de un gran número de compuestos individuales en matrices altamente complejas, como lo son los alimentos y extractos fenólicos de alimentos (Motilva, Serra & Macià, 2013). Los detectores de masas facilitan la identificación de señales cromatográficas por la asignación de un valor de masa/carga específico para cada una de ellas, incluso cuando las señales de dos o más compuestos coinciden; sin embargo, la identificación de compuestos nuevos, para los que no hay estándares disponibles, requiere del uso de equipos de masas en tándem que proveen información estructural gracias a los patrones de fragmentación de los iones precursores seleccionados (Abu-Reidah, 2013).

En el presente trabajo, se analizaron extractos de nuez pecana y almendra mediante un sistema de HPLC acoplado a masas en tándem (HPLC-QTOF), tomando en cuenta que las características de la columna y método cromatográfico se pueden considerar propias de una cromatografía de ultra alta eficiencia (Motilva, Serra & Macià, 2013). Asimismo, el detector de tiempo de vuelo (TOF) tiene la capacidad de asignar masas con alta exactitud (errores menores a 10 ppm), permitiendo identificar compuestos diferentes con masas muy similares. Se comparó además la identidad de los compuestos presentes en extractos de acetona: agua con la de extractos etanol: agua y aunque ambos solventes tienen características similares, se ha reportado a la acetona como uno de los mejores solventes para extraer polifenoles poliméricos de tipo taninos, muy abundantes en las nueces (Álvarez-Parrilla, Urrea-López & de la Rosa, 2018); mientras que el etanol presenta ventajas por ser considerado apto para el consumo humano, pero hay muy pocos estudios que analizan extractos etanólicos de nueces por HPLC acoplado a masas. En todas las muestras analizadas se realizó una primera identificación (identificación tentativa) de CF mediante el software Qualitative analysis B.07.00 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) utilizando un algoritmo que combina la asignación de masas exactas con la comparación de los patrones de distribución isotópica de los iones extraídos de cada señal cromatográfica.

Materiales y métodos

Extracción de CF

Las muestras de almendra y nuez pecana fueron adquiridas en comercios de Ciudad Juárez en abril de 2017; las de nuez se descascararon manualmente desechando las cáscaras, las de almendra provenientes de Estados Unidos se compraron sin cáscara. Antes de extraer los CF se realizó un proceso de desgrasado, de acuerdo a la metodología reportada por de la Rosa, Álvarez-Parrilla & Shahidi (2011). Para ello, se homogenizaron 10 g de nuez o almendra con 100 mL de hexano en un homogenizador (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA) a 8000 rpm durante 3 minutos, la mezcla se filtró al vacío con papel filtro Whatman # 4. Se separó el hexano conteniendo el aceite y el procedimiento se repitió dos veces más sobre el residuo sólido. Finalmente, el aceite se recuperó de los extractos hexánicos combinados, mientras que el residuo sólido (harina desgrasada) se secó al aire durante toda la noche en una campana de extracción y se almacenó a -20 °C hasta su uso como fuente de CF. Los CF se obtuvieron mediante una extracción con solvente asistida por ultrasonido (Torres-Aguirre et al., 2018). Para ambas muestras se obtuvieron dos tipos de extractos: uno con etanol y otro con acetona ambos al 80% v/v en agua destilada. Un gramo de harina desgrasada se colocó en un tubo de 25 mL, se agregaron 10 mL de solvente y se colocaron en un baño de ultrasonido (Branson modelo 5800, Danbury, CT, USA) durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los tubos se centrifugaron en una centrífuga refrigerada (Eppendorff modelo AG 5810R, Hamburg, Germany) durante 15 min a 3,500 rpm y a 4 °C; se recuperó el sobrenadante y el precipitado fue re-extraído. Finalmente, los sobrenadantes de ambas extracciones fueron combinados, el solvente eliminado por medio de un rotavapor (Buchi modelo AG R-3, Flawil, Suiza) a 45 °C y el agua restante por liofilización (Labconco Freezone 6, Kansas City, MO, USA) durante 48 h. Los extractos secos fueron empacados al vacío y almacenados hasta su análisis por HPLC-MS/MS.

Identificación de CF

Los extractos secos fueron disueltos en metanol al 80% (v/v en agua) y diluidos (1:1) en agua para una concentración final de 2 mg de extracto por mL. Todos los disolventes fueron grado LC-MS. Estas muestras fueron filtradas a través de un filtro de jeringa de nylon, 0.45 μηι e inyectadas al equipo de HPLC acoplado a masas (HPLC-QTOF Agilent Modelo G6530, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) equipado con una columna Kinetex® biphenyl de 50 x 2.1 mm con un tamaño de partícula de 2.6 μm y un tamaño de poro de 100 Å (Phenomenex, Torrance, CA, USA) Para la separación cromatográfica se utilizó un gradiente de dos fases móviles (fase A, ácido fórmico al 0.1 % en agua; fase B, ácido fórmico al 0.1 % en metanol) con un flujo de 0.4 mL/min y un volumen de inyección de 1 μL. El gradiente se programó de la siguiente manera: 10-100 % de B de los 0 a los 8 minutos; 100 % B de los 8 a los 9.5 minutos; 100-10 % de B de los 9.5 a los 9.6 minutos.

La detección e identificación de los CF se realizó mediante un analizador de masas en tándem cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF) con una fuente de ionización por electrospray (ESI). Se utilizó ionización negativa con las siguientes condiciones: voltaje del capilar 4,000 V, presión del gas nebulizador 40 psi, temperatura del gas de secado 350 oC y flujo de 10 L/min. Las condiciones de voltaje del TOF fueron: fragmentador 150 V skimmer 65 V y octopolo 750 V. La fragmentación de los iones precursores se llevó a cabo mediante un método no dirigido (Auto MS/MS), seleccionando los 5 iones más abundantes de cada señal cromatográfica y una rampa de energías de colisión desde -10 hasta -40 V. Se utilizó un algoritmo de identificación por base de datos, donde la base de datos se construyó utilizando los CF más abundantes en alimentos, así como los CF reportados en la literatura característicos de diferentes tipos de frutos secos, limitándose a almendra y nuez pecana y otros de naturaleza química similar. Se realizó una identificación tentativa por comparación de la masa calculada vs la masa teórica (registrada en la base de datos) aunada al análisis de la distribución isotópica del ion extraído. Dentro de los criterios de identificación, también se consideró un porcentaje de identidad (score) mayor al 70 %, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, que recomienda un score mayor al 50% para la identificación tentativa, y una abundancia del ion mayor a 1,000 cuentas en los extractos de almendra y mayor a 5,000 cuentas en los extractos de nuez pecana debido a que la abundancia de los iones individuales fue más alta en general en los extractos de nuez pecana. La identidad de los compuestos más abundantes fue confirmada o descartada por su patrón de fragmentación el cual se comparó con el de bases de datos de espectros de masas (Metlin integrada al software MassHunter PCDL Manager for Metabolomics B.07.00 [Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA] y The Human Metabolome Database [www.hmdb.ca]) y lo reportado en literatura.

Resultados y discusión

En la Figura 1 se muestra, como ejemplo, el proceso para realizar la identificación tentativa y confirmación por MS/MS de la estructura de un compuesto abundante en los extractos de nuez pecana (monogaloil glucosa, compuesto 6 de la Tabla I). La Figura 1A corresponde al cromatograma de ion total (TIC). El primer análisis de la muestra consiste en obtener los cromatogramas de ion extraído (Figura 1B) de todos los compuestos cuyas masas exactas coincidían con las de la base de datos (con un error menor a 10 ppm). Para cada compuesto identificado se comparó la distribución isotópica encontrada en la muestra con la teórica de acuerdo con su fórmula molecular (Figura 1C). Con esta información se obtuvo la identificación tentativa en un primer nivel (Tablas II y I). A continuación se analizaron los patrones de fragmentación de los cinco iones más abundantes en cada tiempo de retención, en la Figura 1D se muestra el espectro de masas de monogaloil glucosa (rt 0.86), donde se observa la abundancia del ion precursor, de los fragmentos principales y las estructuras de los tres iones: el ion molecular (que fue el ion precursor) y los dos fragmentos más abundantes (estructuras teóricas según www.hmdb.ca).

Tabla I

Identificación tentativa de compuestos fenólicos en extractos de nuez pecana (Carya illinoinensis) mediante HPLC-MS.

Comp. Rt [M-H]- Masa calculada Masa teórica Fórmula Identificación tentativa Abundancia del ion
Ex. Ac. Ex. Et.
1 0.52 665.2103 666.2176 666.2160 C31 H38 O16 Syringaresinol malonilhexósido ND 5,568
2 0.52 191.0181 192.0253 192.0270 C6 H8 O7 Ácido cítrico ND 102,174
3 0.63 481.0598 482.0677 482.0697 C20 H18 O14 HHDP-glucosa 55,401 21,843
4 0.86 261.0053 262.0128 262.0147 C9 H10 O7 S Sulfato de ácido dihidrocafeico 11,360 ND
5 0.86 865.1974 866.2047 866.2058 C45 H38 O18 Trímero de procianidina tipo B 18,574 15,976
6 0.86 331.0647 332.0720 332.0743 C13 H16 O10 Monogaloil-glucosa (glucogaliina) 131,130 191,047
7 0.98 633.0716 634.0789 634.0806 C27 H22 O18 Galoil-HHDP-glucosa 9,782 ND
8 0.98 305.0638 306.0713 306.0740 C15 H14 O7 (Epi)Galocatequina 35,170 ND
9 0.98 315.0697 316.0769 316.0794 C13 H16 O9 Hexósido de ácido protocatéquico 131,670 144,745
10 0.98 483.0772 484.0849 484.0853 C20 H20 O14 Digaloil-glucosa ND 4,058
11 1.55 329.0856 330.0932 330.0951 C14 H18 O9 Glicósido de ácido vanílico 11,688 15,602
12 1.67 633.0713 634.0785 634.0806 C27 H22 O18 Galoil-HHDP-glucosa 12,651 6,138
13 2.01 451.1221 452.1293 452.1319 C21 H24 O11 Hexósido de (epi)catequina 43,565 46,769
14 2.01 783.0678 784.0749 784.0759 C34 H24 O22 Di-HHDP-glucosa (pedunculagina o casuarina) 135,382 75,599
15 2.59 289.0692 290.0764 290.0790 C15 H14 O6 Catequina (por Rt) 139,824 185,404
16 2.75 881.1917 882.1988 882.2007 C45 H38 O19 Trímero de prodelfinidina tipo B 12,961 9,028
17 2.93 783.0684 784.0755 784.0759 C34 H24 O22 Di-HHDP-glucosa (pedunculagina o casuarina) 136,513 52,150
18 3.05 577.1334 578.1408 578.1424 C30 H26 O12 Dímero de procianidina tipo B 120,412 91,105
19 3.39 935.0779 936.0864 936.0869 C41 H28 O26 Galoil-pedunculagina o isómero 9,541 ND
20 3.85 865.1972 866.2043 866.2058 C45 H38 O18 Trímero de procianidina tipo B 62,593 96,169
21 3.85 633.072 634.0792 634.0806 C27 H22 O18 Galoil-HHDP-glucosa 150,874 88,064
22 4.2 935.0793 936.0866 936.0869 C41 H28 O26 Galoil-pedunculagina o isómero 83,354 26,383
23 4.43 337.0905 338.0977 338.1002 C16 H18 O8 Ácido coumaroilquínico 105,728 117,010
24 4.54 1153.2620 1154.2685 1154.2692 C60 H50 O24 Tetrámero de procianidina tipo B 19,574 15,566
25 4.54 577.1334 578.1406 578.1424 C30 H26 O12 Dímero de procianidina tipo B 204,365 74,543
26 4.89 933.0639 934.0725 934.0712 C41 H26 O26 Praecoxina D o isómero 33,140 ND
27 5.12 865.1966 866.2036 866.2058 C45 H38 O18 Trímero de procianidina tipo B ND 27,877
28 5.23 635.0878 636.0951 636.0963 C27 H24 O18 Trigaloil-glucosa 11,255 ND
29 5.23 513.0820 514.0888 514.0878 C22 H23 Cl O12 Petunidina-3-galactosa (Cl-) 27,189 23,484
30 5.46 463.0505 464.0577 464.0591 C20 H16 O13 Hexósido de ácido elágico 29,338 31,037
31 5.58 453.1333 454.1403 454.1416 C28 H22 O6 Dímero de resveratrol 7,268 17,945
32 5.58 469.0040 470.0111 470.0121 C21 H10 O13 Dilactona del ácido valoneico 11,504 4,841
33 5.6 5.69 1103.0870 1104.0944 1104.0928 C48 H32 O31 Praecoxina C o isómero 69,791 24,582
34 5.69 787.0983 788.1051 788.1072 C34 H28 O22 Tetragaloil-glucosa 7,948 7,523
35 6.04 433.0392 434.0464 434.0485 C19 H14 O12 Pentósido de ácido elágico 374,302 448,327
36 6.27 507.1119 508.1193 508.1217 C23 H24 O13 Syringetín-3-glucósido 12,442 19,009
37 6.27 300.9961 302.0034 302.0063 C14 H6 O8 Ácido elágico 45,893 54,266
38 6.84 477.0656 478.0734 478.0747 C21 H18 O13 Hexósido de metil-ácido elágico o Quercetín-glucurónido 19,978 39,800
39 6.96 585.0503 586.0578 586.0595 C26 H18 O16 Galoil-pentósido de ácido elágico 88,585 71,022
40 7.07 447.0551 448.0624 448.0642 C20 H16 O12 Pentósido de metil-ácido elágico 53,997 123,150
41 7.3 315.0128 316.0201 316.0219 C15 H8 O8 Metil-ácido elágico 102,982 56,142
42 7.54 599.0656 600.0727 600.0751 C27 H20 O16 Galoil-pentósido de metil-ácido elágico 81,126 87,862
43 8.23 447.1324 448.1391 448.1369 C22 H24 O10 Di(4-hidroxifenilacetil)-hexosa 28,496 27,677

[i] Rt: tiempo de retención; Ex. Ac: extracto acetónico 70%; Ex. Et: extracto etanólico 70%; HHDP: hexahidroxidifenoil. ND: no detectado.

Tabla II

Identificación tentativa de compuestos fenólicos en extractos de almendra (Prunus dulcis) mediante HPLC-MS.

Comp. Rt [M-H]- Masa calculada Masa teórica Fórmula Identificación tentativa Abundancia del ion
Ex. Ac. Ex. Et.
1 0.51 191.0178 192.0251 192.0270 C6 H8 O7 Ácido cítrico 212,251 ND
2 0.63 665.2096 666.2169 666.2160 C31 H38 O16 Syringaresinol malonilhexósido ND 3,800
3 0.86 147.0448 148.0520 148.0524 C9 H8 O2 Ácido cinámico ND 1,643
4 0.97 315.0698 316.0776 316.0794 C13 H16 O9 Hexósido de ácido protocatéquico 12,145 ND
5 2.24 329.0867 330.0943 330.0951 C14 H18 O9 Glucósido de ácido vanílico 6,831 4,599
6 2.58 289.0698 290.0772 290.0790 C15 H14 O6 Catequina (por Rt) 20,624 23,077
7 3.62 465.1032 466.1105 466.1111 C21 H22 O12 Hexósido de taxifolina ND 1,894
8 4.08 517.1535 518.1611 518.1636 C22 H30 O14 Dihexósido de ácido fenilico 9,997 10,670
9 4.31 329.0859 330.0931 330.0951 C14 H18 O9 Glicósido de ácido vanílico 10,414 7,071
10 4.43 289.0696 290.0770 290.0790 C15 H14 O6 Epicatequina (por Rt) 3,457 14,255
11 5.00 577.1350 578.1427 578.1424 C30 H26 O12 Dímero de procianidina tipo B 5,408 3,305
12 5.92 499.0634 500.0713 500.0722 C21 H21 Cl O12 Hexósido de delfinidina (Cl-) 8,086 4,666
13 6.04 463.0863 464.0946 464.0955 C21 H20 O12 Hexósido de quercetina 13,870 7,637
14 6.15 287.0534 288.0607 288.0634 C15 H12 O6 Eriodictyol o Dihidrokaempferol 57,302 82,012
15 6.16 449.1064 450.1133 450.1162 C21 H22 O11 Ramnósido de taxifolina o Hexósido de eriodictyol o dihidrokaempferol ND 6,335
16 6.16 300.9976 302.0048 302.0063 C14 H6 O8 Ácido elágico ND 2,351
17 6.38 593.1492 594.1567 594.1585 C27 H30 O15 Diglicósido de apigenina o Rutinósido de kaempferol 40,491 23,488
18 6.38 447.0908 448.0982 448.1006 C21 H20 O11 Hexósido de kaempferol 19,502 4,736
19 6.61 477.1021 478.1093 478.1111 C22 H22 O12 Glicósido de isoramnetina 284,349 169,602
20 6.73 433.1114 434.1191 434.1213 C21 H22 O10 Naringenina-C-hexósido 34,759 21,561
21 6.73 513.0769 514.0867 514.0878 C22 H23 Cl O12 Petunidina-3-galactósido (Cl-) 5,105 ND
22 6.96 301.0332 302.0401 302.0427 C15 H10 O7 Quercetina 43,450 ND
23 6.96 585.0509 586.0582 586.0595 C26 H18 O16 Ácido elágico-galoil-pentósido ND 4,722
24 7.42 285.0377 286.045 286.0477 C15 H10 O6 Kaempferol o luteolina 81,610 52,137
25 7.42 271.0589 272.0661 272.0685 C15 H12 O5 Naringenina 96,235 100,288
26 7.65 315.0498 316.0569 316.0583 C16 H12 O7 Isoramnetina o azaleatina 878,654 473,504
27 7.65 301.0688 302.0762 302.0790 C16 H14 O6 Hesperetina ND 10,096
28 8.22 447.1319 448.1388 448.1369 C22 H24 O10 Di(4-hidroxifenilacetil)-hexosa 41,032 35,486
29 8.57 329.0648 330.0720 330.0740 C17 H14 O7 Caryatina 45,171 ND

[i] Rt: tiempo de retención; Ex. Ac: extracto acetónico 70%; Ex. Et: extracto etanólico 70%. ND: no detectado.

Figura 1

Identificación tentativa de la monogaloil-glucosa en un extracto etanólico de nuez pecana. (A) Cromatograma de ion total (TIC) en modo auto MS/MS del extracto. (B) Superposición de los cromatogramas de ion extraído (EIC) de los compuestos identificados tentativamente en el cromatograma mostrado en A. (C) Comparación de las distribuciones isotópicas identificadas para el ion 331.0647 en comparación con las teóricas de acuerdo a la fórmula de monogaloil glucosa. (D) Espectro de masas obtenido a partir del ion precursor 331.0651 (ion molecular de monogaloil glucosa), donde se muestran las estructuras predichas para el ion precursor y cada uno de sus fragmentos (www.hmdb.ca). Elaborada por los autores.

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La identificación tentativa de algunos compuestos indicó que, de acuerdo con la información de la base de datos, existe más de una posible correspondencia. Las correspondencias múltiples consistieron siempre en diversos isómeros con una misma masa molecular exacta, no en compuestos con masas moleculares similares, como es el caso de los compuestos glicosilados. Sin embargo, hay que considerar que dicha base de datos contiene información limitada, por lo que el número real de compuestos que pueden corresponder a una misma masa (incluso considerando la asignación con alta exactitud) y distribución isotópica determinadas es mucho mayor, ya que para, exactamente, la misma fórmula molecular predicha existen en algunos casos cientos de compuestos posibles (muchos de ellos ni siquiera son CF). A pesar de que la identificación absoluta de un producto natural, mediante la elucidación de su estructura, requiere de un conjunto de técnicas analíticas, especialmente resonancia magnética nuclear, mediante el análisis de los patrones de fragmentación de sus iones moleculares en un espectrómetro de masas en tándem es posible hacer una predicción aproximada de su estructura; lo que, en conjunto con la masa exacta del ion molecular (el ion precursor), nos permite proponer su identidad con una baja incertidumbre (Abu-Reidah, 2013; Fabre, Rustan, Hoffmann & Quetin-Leclercq, 2001; Justesen, 2000).

Una vez considerados todos los criterios de identificación descritos en la sección de Materiales y métodos, los compuestos así identificados en los extractos etanólicos y acetónicos de almendra y nuez pecana se muestran en las Tablas II y I.

Se encontraron un total de 29 compuestos en almendra (22 estuvieron presentes en el extracto acetónico y 24 en el etanólico) y 43 en nuez pecana igual que el anterior (39 en el acetónico y 37 en el etanólico).

En general, tanto el número de compuestos identificados como las abundancias de cada ion individual fueron mayores en los extractos de nuez pecana que en los de almendra. En cuanto a la comparación por solvente de extracción, la acetona resultó ligeramente más efectiva en cuanto al número de compuestos extraídos y la abundancia de los iones identificados; sin embargo, esta diferencia fue muy ligera y se puede atribuir a la diferencia en polaridad de ambos solventes. En ambas muestras se identificó ácido cítrico (en el extracto acetónico para la almendra y en el extracto etanólico para la nuez), siendo más abundante en la almendra. Hasta el momento, no se han encontrado reportes previos de la presencia de este compuesto en almendra o nuez pecana, quizá porque el presente estudio es uno de los primeros análisis no dirigidos que se realiza con estas nueces a diferencia de otros donde no se buscó la presencia de ácidos orgánicos. El número e identidad de los CF presentes en ambos frutos secos fueron, distintos, sin embargo, no hubo diferencias significativas por efecto del disolvente.

Los compuestos más abundantes en almendra fueron los flavonoides de las familias de los flavonoles y las flavanonas, mientras que en nuez pecana fueron taninos hidrolizables (sobre todo elagitaninos) y condensados (en el extracto acetónico) de bajo-mediano peso molecular y algunos ácidos hidroxibenzoicos.

Sólo 7 compuestos identificados en la almendra se encontraron entre los iones que, por su abundancia, fueron fragmentados en sus respectivos tiempos de retención. Sus iones precursores y fragmentos se enlistan en la Tabla III, así como la confirmación o rectificación de su identificación tentativa (Tabla II), por comparación con los fragmentos reportados en bases de datos y literatura científica. La fragmentación del compuesto 1 (Rt 0.51, [M-H]- 191.0178) confirmó que se trata del ácido cítrico (el mismo compuesto con similar tiempo de retención se encontró también en nuez pecana), confirmado en la base de datos Metlin integrada al propio software de identificación. El compuesto 14 (Rt 6.15, [M-H]- 287.0534) mostró dos posibles coincidencias: eriodictyol (una flavanona) o dihidrokaempferol (un dihidroflavonol o flavanonol); ambos han sido reportados previamente en extractos de piel de almendra (Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007), sin embargo, el patrón de fragmentación fue más parecido al de dihidrokaempferol, según lo reportado por Moqbel et al. (2018), quien indica que el fragmento de m/z 259 corresponde a la pérdida de un grupo CO, característica de flavanonoles, mientras que el fragmento de m/z 125 podría corresponder a la fragmentación del anillo A. Esta fragmentación del anillo A se ha reportado también en flavanonas (Fabre, Rustan, Hoffmann & Quetin-Leclercq, 2001), sin embargo, la presencia de ambos fragmentos juntos coincide con lo observado por Moqbel et al. (2018) para dihidrokaempferol, al tiempo que no se encuentran ninguno de los fragmentos más característicos del eriodictyol, motivo por el cual se concluye que el compuesto 14 corresponde a dihidrokaempferol. El compuesto 17 (Rt 6.38, [M-H]- 593.1492) mostró un fragmento de m/z 285, que corresponde a la masa del kaempferol como aglicona, mientras que la diferencia (308) corresponde a la pérdida de un rutinósido (disacárido glucosa-ramnosa), indicando la presencia del rutinósido de kaempferol, que ya ha sido reportado por Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, (2007) en piel de almendra. Aunque esta información no permite descartar la posibilidad de que la aglicona sea luteolina en lugar de kaempferol , (ya que ambos poseen la misma fórmula y masa molecular), no se ha reportado en almendra la presencia de rutinósido de luteolina, infiriendo con un alto grado de certidumbre que el compuesto 17 corresponde a un rutinósido de kaempferol. El compuesto 19 (Rt 6.61, [M-H]- 477.1021) se identificó como glucósido de isoramnetina, a pesar de que en un principio no presentó el ion característico de cualquier glicósido, que consiste en el ion de la aglicona -H (Justesen, 2000) que en este caso sería de una m/z 315. Sin embargo, los fragmentos con m/z 314, 271 y 243 coinciden con los encontrados por Moqbel et al. (2018), quien identificó al glucósido de isoramnetina en hojas y tallos de árbol de almendra, con unas condiciones de ionización muy similares a las utilizadas en el presente trabajo; además el fragmento m/z 151 corresponde a un producto de fragmentación del anillo A característico de flavonas, flavonoles y flavanonas no metilados en dicho anillo, incluyendo a la isoramnetina (Fabre, Rustan, Hoffmann & Quetin-Leclercq, 2001; Justesen, 2000). Los compuestos 25 (Rt 7.42, [M-H]- 271.0589) y 26 (Rt 7.65, [M-H]- 315.0498) fueron identificados fácilmente por tratarse de agliconas: naringenina (una flavanona) e isoramnetina (un flavonol), respectivamente. Sus patrones de fragmentación mostraron los fragmentos característicos descritos en bases de datos y referencias especializadas (Fabre, Rustan, Hoffmann & Quetin-Leclercq, 2001; Justesen, 2000). Por último, el compuesto 28 (Rt 8.22, [M-H]- 447.1319) no pudo ser identificado. La identificación tentativa marcó un compuesto fenólico no flavonoide reportado en lechuga (Abu-Reidah, 2013) sin embargo, su patrón de fragmentación no coincidió.

Tabla III

Confirmación de la identificación tentativa de compuestos fenólicos en extractos de almendra, por comparación de sus patrones de fragmentación en modo negativa con el de bases de datos de espectros de masas (Metlin integrada al software MassHunter PCDL Manager for Metabolomics B.07.00 [Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA] y The Human Metabolome Database [www.hmdb.ca]) y lo reportado en la literatura científica.

Comp. [M-H]- (ion precursor) Fragmentos Fórmula Identificación por patrón de fragmentación Referencia para comparación de fragmentos
1 191.0178 111.007, 87.008, 85.028 C6 H8 O7 Ácido cítrico base de datos Metlin;
14 287.0534 259.058, 125.022 C15 H12 O6 Dihidrokaempferol Moqbel et al, 2018
17 593.1492 285.038 C27 H30 O15 Rutinósido de kaempferol Monagas , Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés , 2007
19 477.1021 314.041, 271.021, 243.027, 151.000 C22 H22 O12 Glicósido de isoramnetina Moqbel et al., 2018
25 271.0589 151.000, 119.048 C15 H12 O5 Naringenina base de datos Metlin; Fabre, Rustan, Hoffmann & Quetin-Leclercq, 2001
26 315.0498 300.025, 151.000 C16 H12 O7 Isoramnetina HMDB; Justesen, 2000
28 447.1319 375.081, 219.837, 162.836 C22 H24 O10 Desconocido

En resumen, los CF más abundantes pudieron ser identificados y confirmada su estructura por HPLC-MS-MS en ambos extractos de almendra y fueron: 1) isoramnetina aglicona, 2) glicósido de isoramnetina y 3) naringenina aglicona. Los dos primeros son flavonoles metilados, y el último una flavanona.

En la Tabla IV se muestran los iones precursores y fragmentos obtenidos en el análisis de la nuez pecana. 24 iones precursores fueron fragmentados, de los cuales 3 se identificaron tentativamente como diferentes isómeros del mismo compuesto, dos procianidinas y un elagitanino. Los compuestos identificados por su patrón de fragmentación pueden dividirse en 5 grupos, según su naturaleza química: 1) glicósidos de ácidos fenólicos (compuesto 9); 2) flavan-3-oles, incluyendo monómeros, glicósidos y procianidinas (compuestos 13, 15, 18, 20, 25 y 27); 3) galotaninos (compuestos 6 y 34); 4) derivados de ácido elágico, con o sin ácido gálico (compuestos 30, 35 y 37-42); y 5) elagitaninos, que contienen al menos una unidad de ácido hexahidroxidifénico (HHDP, compuestos 14, 17, 21, 22, 26 y 33). El compuesto 23 no pudo ser identificado, ya que su patrón de fragmentación no coincidió con el del ácido coumaroilquínico que había sido identificado tentativamente por su masa exacta y distribución isotópica (ver Tabla I).

Tabla IV

Confirmación de la identificación tentativa de compuestos fenólicos en extractos de nuez pecana, por comparación de sus patrones de fragmentación en modo negativa con el de bases de datos de espectros de masas (Metlin integrada al software MassHunter PCDL Manager for Metabolomics B.07.00 [Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA] y The Human Metabolome Database [www.hmdb.ca]) y lo reportado en la literatura científica.

Comp. [M-H]- (ion precursor) Fragmentos Fórmula Identificación por patrón de fragmentación Referencia para comparación de fragmentos
6 331.0647 169.011, 125.022 C13 H16 O10 Monogaloil-glucosa (glucogaliina) HMDB (predicted); Gong & Pegg, 2017; Robbins , Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014
9 315.0697 152.008, 108.019 C13 H16 O9 Hexósido de ácido protocatéquico Abu-Reidah et al., 2018
13 451.1221 289.069, 245.079, 125.021 C21 H24 O11 Hexósido de (epi)catequina HMDB (predicted); Gong & Pegg, 2017; Robbins , Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014
14 783.0678 300.996, 481.059, 275.017 C34 H24 O22 Di-HHDP-glucosa (pedunculagina o isómero) Boulekbache-Makhlouf et al., 2010
15 289.0692 245.079, 109.028 C15 H14 O6 Catequina (por Rt) Metlin
17 783.0684 300.996, 481.059, 275.017 C34 H24 O22 Di-HHDP-glucosa (pedunculagina o isómero) Boulekbache-Makhlouf et al., 2010
18 577.1334 407.074, 289.069, 125.022 C30 H26 O12 Dímero de procianidina tipo B HMDB; Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007
20 865.1972 407.074, 287.053, 289.069, 577.132, 125.022, 695.138 C45 H38 O18 Trímero de procianidina tipo B HMDB; Monagas, Garrido Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007
21 633.072 300.996, 463.049, 169.012 C27 H22 O18 Galoil-HHDP-glucosa Gong & Pegg, 2017
22 935.0793 275.017, 633.069, 299.016, 169.011, 783.069 C41 H28 O26 Galoil-di-HHDP-glucosa (casuarictina o isómero) Boulekbache-Makhlouf et al., 2010; Barry, Davies & Mohamed, 2001
23 337.0905 175.038, 131.048, 157.027 C16 H18 O8 Desconocido
25 577.1334 407.074, 289.069, 125.022 C30 H26 O12 Dímero de procianidina tipo B HMDB; Monagas , Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007
26 933.0639 450.990, 300.996, 633.069, 125.020 C41 H26 O26 Castalagina/vescalagina, praecoxina D o isómero Grace, Warlick, Neff & Lila, 2014; Hager, Howard, Liyanage, Lay & Prior , 2008
27 865.1966 407.076, 289.070, 125.022, 577.136, 695.135 C45 H38 O18 Trímero de procianidina tipo B HMDB; Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007
30 463.0505 299.994 C20 H16 O13 Hexósido de ácido elágico Identificación tentativa
33 1103.087 300.995, 633.068, 935.073, 1059.096, 425.010, 125.019 C48 H32 O31 Sanguina H-2 o isómero Kool, Comeskey, Cooney & McGhie, 2010
34 787.0983 617.074, 169.011, 465.060, 295.040 C34 H28 O22 Tetragaloil-glucosa HMDB (predicted); Boulekbache-Makhlouf et al, 2010
35 433.0392 299.988, 271.056 C19 H14 O12 Pentósido de ácido elágico Identificación tentativa
37 300.9961 185.022, 283.992, 257.007, 229.010 C14 H6 O8 Ácido elágico base de datos Metlin; Mullen, Yokota, Lean & Crozier , 2003
38 477.0656 315.012, 299.986 C21 H18 O13 Hexósido de metil-ácido elágico Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, Wells, Greenspan & Pegg,2014
39 585.0503 300.997, 415.028, 169.011 C26 H18 O16 Galoil pentósido de ácido elágico Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014
40 447.0551 315.011, 299.988 C20 H16 O12 Pentósido de metil-ácido elágico Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, Wells, Greenspan &Pegg, 2014
41 315.0128 299.989, 216.000 C15 H8 O8 Metil-ácido elágico Identificación tentativa
42 599.0656 447.054, 315.011, 169.011 C27 H20 O16 Galoil pentósido de metil-ácido elágico Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, wells, Greenspan & Pegg, 2014

[i] HHDP: hexahidroxidifenoil

El compuesto 9 (Rt 0.98, [M-H]- 315.0697) se identificó como un derivado glicosilado del ácido protocatéquico, aunque no presentó el típico fragmento correspondiente a la pérdida del residuo de azúcar (162) para dar un fragmento de m/z 153 ([M-H]- del ácido protocatéquico), los fragmentos con m/z 152 y 108 han sido detectados por Abu-Reidah, Ali-Shtayeh, Jamous, Arráez-Román & Segura-Carretero, (2015) y corresponden también a la pérdida de un hidrógeno adicional, al residuo de azúcar, seguido de la pérdida de un CO2, característica de los ácidos fenólicos. Algunos hexósidos de ácido protocatéquico han sido reportados en extractos acetónicos de nuez pecana (Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014).

Dentro de los flavan-3-oles, los compuestos 13 y 15 pudieron ser identificados como un hexósido de catequina o epicatequina y como catequina libre, respectivamente. La catequina (Rt 2.59, [M-H]- 289.0692) pudo ser identificada fácilmente por su patrón de fragmentación comparable con el de la base de datos integrada al software, pero para poderla distinguir de su estereoisómero, la epicatequina, fue necesario comparar los Rt de estándares comerciales. En el caso del hexósido, se identificó claramente el fragmento correspondiente a la pérdida del residuo de azúcar (fragmento 289, correspondiente a [M-H]-de catequina o epicatequina), así como otros productos de la fragmentación de la aglicona, aunque no fue posible confirmar de cuál de los dos estereoisómeros se trataba. Los compuestos 18 y 25 (Rt 3.05 y 4.54, [M-H]- 577.1334) corresponden a dímeros de procianidinas tipo B, es decir, dímeros de (epi) catequina unidos entre sí mediante un solo enlace interflavan; mientras que los compuestos 20 y 27 (Rt 3.85 y 5.12, [M-H]-865.197) son trímeros. Sus patrones de fragmentación han sido descritos por Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, (2007): los fragmentos con m/z 695 en trímeros y 407 en dímeros y trímeros son producto de la fragmentación retro-Diels-Adler seguida de la eliminación de una molécula de agua; los fragmentos con m/z 289 en dímeros y trímeros y m/z 287 y 577 en trímeros corresponden a la ruptura del enlace interflavan por un mecanismo quinona-metino (Monagas, Garrido, Lebrón-Aguilar, Bartolomé & Gómez-Cordovés, 2007). Todos estos flavan-3-oles ya han sido reportados en extractos acetónicos de nuez pecana y en el presente trabajo mostramos también su presencia en el extracto etanólico; también se identificaron otros flavan-3-oles oligoméricos como un tetrámero de procianidina B (Rt 4.54, [M-H]- 1153.262) y un trímero de prodelfinidina B (Rt 2.75, [M-H]- 881.1917) que si bien no pudieron ser confirmados por su patrón de fragmentación, también han sido descritos como componentes importantes de la nuez pecana por varios autores (Álvarez-Parrilla, Urrea-López & de la Rosa, 2018).

Los compuestos 6 y 34 se identificaron como galotaninos, estructuras formadas por uno o más residuos galoilo unidos a un núcleo de glucosa. El compuesto 6 (Rt 0.86, [M-H]-331.0647) fue identificado como un monogaloil glucosa (Figura 1) por su [M-H]- y la presencia de fragmentos correspondientes a la pérdida del residuo de azúcar, para dar la [M-H]- del ácido gálico (m/z 169), seguida de la pérdida de un grupo CO2 (m/z 125). El compuesto 34 (Rt 5.69, [M-H]- 787.0983) se identificó como un derivado tetragaloil glucosa con fragmentos característicos de la pérdida de residuos galoilo (152) y galoilo más agua (170), así como la presencia del ion con m/z 169 (Boulekbache-Makhlouf et al., 2010). También el compuesto 28 (trigaloil glucosa) se identificó como galotanino (trigaloil glucosa, Rt 5.23, [M-H]-635.0878) aunque no se obtuvo su patrón de fragmentación. Otros autores han encontrado galotaninos con una y dos unidades de ácido gálico (Alvarez-Parrilla, Urrea-López & de la Rosa, 2018) pero el presente es el primer reporte de las formas tri y tetra galoiladas. Los galotaninos fueron menos abundantes y diversos que los elagitaninos, que serán descritos a continuación.

Se encontraron 8 derivados glicosilados (donde el carbohidrato puede ser hexosa o pentosa, no necesariamente glucosa), metilados o galoilados del ácido elágico, o combinaciones entre ellos; aunque la identidad de los compuestos 30, 35, y 41 no pudo ser del todo confirmada por su patrón de fragmentación. Los compuestos 30 (Rt 5.46, [M-H]- 463.0505) y 35 (Rt 6.04, [M-H]- 433.0392) fueron identificados tentativamente como un hexósido y pentósido de ácido elágico, respectivamente; ambos han sido descritos en nuez pecana (Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014) sin embargo, su fragmento característico tiene una m/z de 301, correspondiente a la pérdida de la hexosa (162) o pentosa (132). En el presente trabajo el fragmento liberado (m/z 300) correspondería a la pérdida del carbohidrato seguido de un átomo de hidrógeno adicional (163 y 133, respectivamente). Otros trabajos han identificado un fragmento similar (m/z 300) como producto de hexósidos y pentósidos de ácido elágico (Sandhu & Gu, 2010); sin embargo, esta información no es suficiente para confirmar la identidad, ya que en nuestros resultados no se observó la presencia de fragmentos característicos del ácido elágico, como son los de m/z 257 y 229 (Mullen, Yokota, Lean & Crozier, 2003). De manera similar, el compuesto 41 (Rt 7.3, [M-H]- 315.0128) puede ser identificado tentativamente como metil-ácido elágico, también descrito previamente en nuez pecana (de la Rosa, Álvarez-Parrilla & Shahidi, 2011), y el fragmento de m/z 300 (299.989 masa exacta), correspondiente a la pérdida del grupo metilo (15), puede considerarse un buen indicador de la identidad del compuesto. Sin embargo, de nuevo, no existen fragmentos característicos del ácido elágico y no se encontraron reportes del patrón de fragmentación del metil ácido elágico, por lo que consideramos que no se cuenta con información suficiente para confirmar su identificación. Por otro lado, el compuesto 37 (Rt 6.27) presentó una [M-H]- de 300.9961 y fragmentos característicos del ácido elágico (incluyendo los de m/z 257 y 229), por lo que pudo ser identificado con certeza. Los compuestos 38 (Rt 6.84, [M-H]- 477.0656) y 40 (Rt 7.07, [M-H]- 447.0551) fueron identificados como derivados glicosilados del metil ácido elágico, hexósido y pentósido, respectivamente. Su identidad pudo ser confirmada por la presencia, en ambos casos, de fragmentos correspondientes a la pérdida del carbohidrato (m/z 315) y a la pérdida del carbohidrato y el grupo metilo (m/z 300). Los compuestos 39 (Rt 6.96, [M-H]- 585.0503) y 42 (Rt 7.54, [M-H]- 599.0656) fueron identificados como galoil pentósidos de ácido elágico y de metil ácido elágico, respectivamente. En ambos casos se observaron fragmentos correspondientes a la pérdida del residuo galoil-pentosa (284), para quedar m/z de 301 para el compuesto 39 y el 315 para el compuesto 42, coincidiendo con lo reportado en la literatura por (Gong & Pegg, 2017; Robbins, Ma, Wells, Greenspan & Pegg, 2014). También se observó en ambos la liberación de ácido gálico (fragmentos con m/z 169), en el compuesto 42 la pérdida de un residuo galoilo (fragmento con m/z 447) y en el compuesto 39 la de un residuo galoilo con una molécula de agua (fragmento con m/z 415). Todos los derivados de ácido elágico encontrados en el presente trabajo ya han sido reportados en nuez pecana (Álvarez-Parrilla, Urrea-López & de la Rosa, 2018).

Finalmente, se encontraron 6 elagitaninos, cuya característica principal es la presencia de grupos HHDP. Cuando el HHDP es liberado por hidrólisis se lactoniza para dar lugar al ácido elágico, que puede ser cuantificado como producto de la hidrólisis de elagitaninos (Gong & Pegg, 2017; Lee, Johnson & Talcott, 2005). Los compuestos 14 y 17 (Rt 2.01 y 2.93, [M-H]- 783.068) fueron identificados como isómeros de di-HHDP-hexosa, probablemente pedunculagina, de acuerdo a su patrón de fragmentación (Boulekbache-Makhlouf et al., 2010). En ambos se observaron los mismos fragmentos: el de m/z 301 (300.996) que corresponde a la liberación de ácido elágico por la pérdida de un grupo HHDP-glucosa (482) y el de m/z 481 que corresponde a la pérdida de un grupo HHD qu P (302). También se observó un fragmento de m/z 275, sin embargo no se encontró el que corresponde a la pérdida de una molécula de agua, característico de elagitaninos con enlace C-glicosídico en los que la molécula de glucosa se encuentra en conformación abierta (Boulekbache-Makhlouf et al., 2010; Barry, Davies & Mohamed, 2001), por lo que se considera probable que estos compuestos correspondan a dos anómeros de la pedunculagina u otras formas de di-HHDP-hexosa con enlace O-glicosídico. No existen reportes previos de este compuesto en extractos de nuez pecana. El compuesto 21, (Rt 3.85, [M-H]- 633.072) correspondió al galoil-HHDP-glucosa, que había sido identificado por Gong & Pegg (2017) en nuez pecana, por la presencia de fragmentos correspondientes a la pérdida del residuo galoilo más agua (fragmento con m/z 463) y a la liberación de ácido elágico (fragmento con m/z 301 [masa exacta de 300.996]); en el presente análisis también se pudo observar un fragmento correspondiente a la liberación de ácido gálico (m/z 169). Cabe mencionar que se identificaron por su masa exacta y distribución isotópica otros dos isómeros de galoil-HHDP-glucosa (compuestos 7, Rt 0.98 y 12, Rt 1.67).

El compuesto 22 (Rt 4.2) presentó una [M-H]- de 935.0793 con un fragmento de m/z 633 correspondiente a la pérdida de un residuo HHDP-glucosa, así como uno de m/z 783 por la pérdida de un residuo galoilo. Se presentaron también otros fragmentos (m/z 275 y m/z 169, similares a los encontrados en galotaninos antes descritos) pero ninguno correspondiente a la pérdida de una molécula de agua, lo que sugiere que este compuesto es un isómero de casuarictina, es decir un galoil-di-HDDP-glucosa con conformación cerrada de la glucosa (Boulekbache-Makhlouf et al., 2010; Barry, Davies & Mohamed, 2001). Este compuesto mostró un isómero con Rt de 3.39 (compuesto 19, Tabla I). El compuesto 26 (Rt 4.89) mostró una [M-H]- de 933.0639, dos unidades menor que el compuesto 22 (galoil-di-HDDP-glucosa), lo que indica la formación de un enlace por oxidación entre el grupo galoil y un grupo HHDP adyacente (Barry, Davies & Mohamed, 2001). Este tipo de estructura puede corresponder a elagitaninos como castalagina/vescalagina o praecoxina-D, aunque el patrón de fragmentación y la literatura disponible no permiten distinguirlo con certeza. Sin embargo, si es posible aseverar que se trata de alguno de estos taninos, ya que muestra fragmentos como el de m/z 451 (450.99) que corresponde a la liberación de un residuo trigaloilo y el de m/z 301 (300.996) correspondiente a la liberación de ácido elágico; estos fragmentos han sido descritos por Hager, Howard, Liyanage, Lay & Prior, (2008), quien identificó castalagina/vescalagina mediante HPLC-MS/MS en extractos de zarzamoras (Rubus sp.), y por Grace, Warlick, Neff & Lila, (2014), quien aisló y caracterizó la fragmentación de praecoxina D a partir de extractos de nuez de Castilla (Juglans regia). Por último, el compuesto 33 (Rt 5.6-5.69, [M-H]- 1103.087) se identificó como sanguina H-2 de acuerdo a la comparación de su patrón de fragmentación con el descrito por Kool, Comeskey, Cooney & McGhie, (2010), quien aisló y caracterizó a este compuesto a partir de extractos de zarzamora de la especie Rubus loganbaccus x baileyanus, observando fragmentos de m/z 1059, 935 y 633, los mismos que fueron detectados en el presente estudio. Una búsqueda bibliográfica exhaustiva nos indicó que este es el primer estudio que reporta la presencia de elagitaninos como casuarictina, castalagina/vescalagina, praecoxina D o sanguina H-2 en nuez pecana. Los compuestos más abundantes en el extracto acetónico de nuez pecana fueron el pentósido de ácido elágico (solo identificación tentativa), el dímero de procianidina B con Rt 4.54 y el galoil-HHDP-glucosa con Rt 3.85. En el extracto etanólico también fue más abundante el pentósido de ácido elágico, seguido por monogaloil glucosa y catequina libre.

Conclusiones

Este estudio permitió demostrar que el perfil polifenólico de la almendra y nuez pecana es claramente diferente, dominando en la primera flavonoides y en la segunda taninos condensados e hidrolizables (sobre todo elagitaninos). Se describió por primera vez la presencia de elagitaninos como casuarictina, castalagina/vescalagina, praecoxina D o sanguina H-2 en nuez pecana. Por otro lado, se demostró también que los extractos etanólicos muestran una riqueza, en cantidad y diversidad, de CF similar al de los extractos acetónicos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a CONACYT por el financiamiento otorgado al proyecto CB-2016-286449, así como a la UACJ y al CIATEJ por las facilidades otorgadas para la realización de una estancia sabática de Laura A. de la Rosa y Emilio Álvarez-Parrilla. A Víctor M. Alcantar Rosales del CIATEJ por su valioso apoyo para realizar el análisis de las muestras en el HPLC-QTOF. A Jasmín C. Stevens Barrón y Gaspar A. Torres Aguirre por su apoyo en la obtención de los extractos.

Referencias

1 

Abu-Reidah, I.M., (2013). Characterization of phenolic compounds in highly-consumed vegetable matrice by using advanced analytical techniques (Caracterización de compuestos fenólicos en matrices vegetales mediante técnicas analíticas avanzadas). Doctoral thesis, Granada: Editorial de la Universidad de Granada.

I.M. Abu-Reidah 2013Characterization of phenolic compounds in highly-consumed vegetable matrice by using advanced analytical techniques (Caracterización de compuestos fenólicos en matrices vegetales mediante técnicas analíticas avanzadas)DoctoralthesisGranadaEditorial de la Universidad de Granada

2 

Abu-Reidah, I. M., Ali-Shtayeh, M. S., Jamous, R. M., Arráez-Román, D. & Antonio Segura-Carretero, A. (2015). HPLC-DAD-ESI-MS/MS screening of bioactive components from Rhus coriaria L. (Sumac) fruits. Food Chem ., 166, 179-191. DOI: 10.1016/j.foodchem.2014.06.011.

I. M. Abu-Reidah M. S. Ali-Shtayeh R. M. Jamous D. Arráez-Román A Antonio Segura-Carretero 2015HPLC-DAD-ESI-MS/MS screening of bioactive components from Rhus coriaria L. (Sumac) fruitsFood Chem166,17919110.1016/j.foodchem.2014.06.011

3 

Alasalvar, C. & Shahidi, F. (2008). Tree nuts: Composition, phytochemicals, and health effects. Boca Raton: CRC Press.

C. Alasalvar F Shahidi 2008Tree nuts: Composition, phytochemicals, and health effectsBoca RatonCRC Press

4 

Álvarez-Parrilla, E., Urrea-López, R. & de la Rosa, L. A. (2018). Bioactive components and health effects of pecan nuts and their by-products: a review. J. Food Bioact ., 1, 56-92. DOI: 10.31665/JFB.2018.1127.

E. Álvarez-Parrilla R. Urrea-López L. A de la Rosa 2018Bioactive components and health effects of pecan nuts and their by-products: a reviewJ. Food Bioact1,569210.31665/JFB.2018.1127

5 

Aune, D., Keum, N., Giovannucci, E., Fadnes, L. T., Boffetta, P., Greenwood, D. C., Tonstad, S., Vatten, L. J., Riboli, E. & Norat, T. (2016). Nut consumption and risk of cardiovascular disease, total cancer, all-cause and cause specific mortality: a systematic review and dose-response meta-analysis of prospective studies. BMC Medicine, 14:207, 1-14. DOI: 10.1186/s12916-016-0730-3.

D. Aune N. Keum E. Giovannucci L. T. Fadnes P. Boffetta D. C. Greenwood S. Tonstad L. J. Vatten E. Riboli T Norat 2016Nut consumption and risk of cardiovascular disease, total cancer, all-cause and cause specific mortality: a systematic review and dose-response meta-analysis of prospective studiesBMC Medicine14:207,11410.1186/s12916-016-0730-3

6 

Barry, K. M., Davies, N. W. & Mohamed, C. L. (2001). Identification of hydrolysable tannins in the reaction zone of Eucalyptus nitens wood by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionisation Mass Spectrometry. Phytochem. Anal ., 12, 120-127. DOI:10.1002/pca.548.

K. M. Barry N. W. Davies C. L Mohamed 2001Identification of hydrolysable tannins in the reaction zone of Eucalyptus nitens wood by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionisation Mass SpectrometryPhytochem. Anal12,12012710.1002/pca.548

7 

Boulekbache-Makhlouf, L., Meudec, E., Chibane, M., Mazaruic, J. -P., Slimani, S., Henry, M., Cheynier, V. & Madani, K. (2010). Analysis by High-Performance Liquid Chromatography Diode Array Detection Mass Spectrometry of phenolic compounds in fruit of Eucalyptus globulus cultivated in Algeria. J. Agric. Food Chem ,. 58, 12615-12624. DOI: 10.1021/jf1029509.

L. Boulekbache-Makhlouf E. Meudec M. Chibane J. -P. Mazaruic S. Slimani M. Henry V. Cheynier K Madani 2010Analysis by High-Performance Liquid Chromatography Diode Array Detection Mass Spectrometry of phenolic compounds in fruit of Eucalyptus globulus cultivated in AlgeriaJ. Agric. Food Chem58,126151262410.1021/jf1029509

8 

Chang, S. K., Alasalvar, C., Bolling, B. W. & Shahidi, F. (2016). Nuts and their co-products: The impact of processing (roasting) on phenolics, bioavailability, and health benefits - A comprehensive review. J. Funct. Foods, 26, 88-122. DOI: 10.1016/j.jff.2016.06.029 .

S. K. Chang C. Alasalvar B. W. Bolling F Shahidi 2016Nuts and their co-products: The impact of processing (roasting) on phenolics, bioavailability, and health benefits - A comprehensive reviewJ. Funct. Foods26,8812210.1016/j.jff.2016.06.029

9 

de la Rosa, L. A., Álvarez-Parrilla, E. & Shahidi, F. (2011) Phenolic compounds and antioxidant activity of kernels and shells of mexican pecan (Carya illinoinensis). J. Agric. Food Chem ., 59, 152-162. DOI: 10.1021/jf1034306

L. A. de la Rosa E Álvarez-Parrilla F Shahidi 2011Phenolic compounds and antioxidant activity of kernels and shells of mexican pecan (Carya illinoinensis)J. Agric. Food Chem59,15216210.1021/jf1034306

10 

Fabre, N., Rustan, I., Hoffmann, E. & Quetin-Leclercq, J. (2001). Determination of flavone, flavonol, and flavanone aglycones by negative ion liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom ., 12, 707-715. DOI: 10.1016/S1044-0305(01)00226-4.

N. Fabre I. Rustan E. Hoffmann J Quetin-Leclercq 2001Determination of flavone, flavonol, and flavanone aglycones by negative ion liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometryJ. Am. Soc. Mass Spectrom12,70771510.1016/S1044-0305(01)00226-4

11 

Gong, Y. & Pegg, R. B. (2017). Separation of ellagitannin-rich phenolics from U.S. pecans and chinese hickory nuts using Fused-Core HPLC columns and their characterization. J. Agric. Food Chem ., 65, 5810-5820. DOI: 10.1021/acs. jafc.7b01597.

Y. Gong R. B Pegg 2017Separation of ellagitannin-rich phenolics from U.S. pecans and chinese hickory nuts using Fused-Core HPLC columns and their characterizationJ. Agric. Food Chem65,5810582010.1021/acs. jafc.7b01597

12 

Grace, M. H., Warlick, C. C., Neff, S. A. & Lila, M. A. (2014). Efficient preparative isolation and identification of walnut bioactive components using high-speed counter-current chromatography and LC-ESI-IT-TOF-MS. Food Chem ., 158, 229-238. DOI: 10.1016/j.foodchem.2014.02.117

M. H. Grace C. C. Warlick S. A. Neff M. A Lila 2014Efficient preparative isolation and identification of walnut bioactive components using high-speed counter-current chromatography and LC-ESI-IT-TOF-MSFood Chem158,22923810.1016/j.foodchem.2014.02.117

13 

Hager, T. J., Howard, L. R., Liyanage, R., Lay, J. O. & Prior, R. L. (2008). Ellagitannin composition of blackberry as determined by HPLC-ESI-MS and MALDI-TOF-MS. J. Agric. Food Chem ., 56, 661-669. DOI: 10.1021/jf071990b.

T. J. Hager L. R. Howard R. Liyanage J. O. Lay R. L Prior 2008Ellagitannin composition of blackberry as determined by HPLC-ESI-MS and MALDI-TOF-MSJ. Agric. Food Chem56,66166910.1021/jf071990b

14 

Justesen, U. (2000). Negative atmospheric pressure chemical ionisation low-energy collision activation mass spectrometry for the characterisation of flavonoids in extracts of fresh herbs. J. Chromatogr. A, 902, 369-379. DOI: 10.1016/S0021-9673(00)00861-X.

U Justesen 2000Negative atmospheric pressure chemical ionisation low-energy collision activation mass spectrometry for the characterisation of flavonoids in extracts of fresh herbsJ. Chromatogr. A902,36937910.1016/S0021-9673(00)00861-X

15 

Kool, M. M., Comeskey, D. J., Cooney, J. M. & McGhie, T. K. (2010). Structural identification of the main ellagitannins of a boysenberry (Rubus loganbaccus x baileyanus Britt.) extract by LC-ESI-MS/MS, MALDI-TOF-MS and NMR spectroscopy. Food Chem ., 119, 1535-1543. DOI: 10.1016/j.foodchem.2009.09.039.

M. M. Kool D. J. Comeskey J. M. Cooney T. K McGhie 2010Structural identification of the main ellagitannins of a boysenberry (Rubus loganbaccus x baileyanus Britt.) extract by LC-ESI-MS/MS, MALDI-TOF-MS and NMR spectroscopyFood Chem119,1535154310.1016/j.foodchem.2009.09.039

16 

Lamuel-Raventos, R. M. & St. Onge, M. -P. (2017). Prebiotic nut compounds and human microbiota. Crit. Rev. Food Sci. Nutr ., 57, 3154-3163. DOI: 10.1080/10408398.2015.1096763.

R. M. Lamuel-Raventos M. -P St. Onge 2017Prebiotic nut compounds and human microbiotaCrit. Rev. Food Sci. Nutr57,3154316310.1080/10408398.2015.1096763

17 

Lee, J. -H., Johnson, O. V. & Talcott, S. T. (2005). Identification of ellagic acid conjugates and other polyphenolics in muscadine grapes by HPLC-ESI-MS. J. Agric. Food Chem ., 53, 6003-6010. DOI: 10.1021/jf050468r.

J. -H. Lee O. V. Johnson S. T Talcott 2005Identification of ellagic acid conjugates and other polyphenolics in muscadine grapes by HPLC-ESI-MSJ. Agric. Food Chem53,6003601010.1021/jf050468r

18 

Monagas, M., Garrido, I., Lebrón-Aguilar, R., Bartolomé, B. & Gómez-Cordovés, C. (2007). Almond (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb) skins as a potential source of bioactive polyphenols. J. Agric. Food Chem ., 55, 8498-8507. DOI: 10.1021/jf071780z.

M. Monagas I. Garrido R. Lebrón-Aguilar B. Bartolomé C Gómez-Cordovés 2007Almond (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb) skins as a potential source of bioactive polyphenolsJ. Agric. Food Chem55,8498850710.1021/jf071780z

19 

Moqbel, H., Hawary, S. S. E. D. E., Sokkar, N. M., El-Naggar, E. M. B., Boghdady, N. E. & Halawany, A. M. E. (2018). HPLC-ESI-MS/MS characterization of phenolics in Prunus amygdalus, cultivar "umm alfahm" and its antioxidant and hepatoprotective activity. J. Food Meas. Charact ., 12, 808-819. DOI: 10.1007/s11694-017-9695-.

H. Moqbel S. S. E. D. E. Hawary N. M. Sokkar E. M. B. El-Naggar N. E. Boghdady A. M. E Halawany 2018HPLC-ESI-MS/MS characterization of phenolics in Prunus amygdalus, cultivar "umm alfahm" and its antioxidant and hepatoprotective activityJ. Food Meas. Charact12,80881910.1007/s11694-017-9695

20 

Motilva, M. -J., Serra, A. & Macià, A. (2013). Analysis of food polyphenols by ultra high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry: An overview. J. Chromatogr. A., 1292, 66-82. DOI: 10.1016/j. chroma.2013.01.012.

M. -J. Motilva A. Serra A Macià 2013Analysis of food polyphenols by ultra high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry: An overviewJ. Chromatogr. A1292,668210.1016/j. chroma.2013.01.012

21 

Mullen, W., Yokota, T., Lean, M. E. J. & Crozier, A. (2003). Analysis of ellagitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in raspberry fruits by LC-MSn. Phytochem., 64, 617-624. DOI: 10.1016/S0031-9422(03)00281-4.

W. Mullen T. Yokota M. E. J. Lean A Crozier 2003Analysis of ellagitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in raspberry fruits by LC-MSnPhytochem64,61762410.1016/S0031-9422(03)00281-4

22 

Robbins, K. S., Ma, Y., Wells, M. L., Greenspan, P. & Pegg, R. B. (2014). Separation and characterization of phenolic compounds from U.S. pecans by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem ., 62, 4332-4341. DOI: 10.1021/jf500909h.

K. S. Robbins Y. Ma M. L. Wells P. Greenspan R. B Pegg 2014Separation and characterization of phenolic compounds from U.S. pecans by Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryJ. Agric. Food Chem62,4332434110.1021/jf500909h

23 

Sandhu, A. K. & Gu, L. (2010). Antioxidant capacity, phenolic content, and profiling of phenolic compounds in the seeds, skin, and pulp of Vitis rotundifolia (Muscadine grapes) as determined by HPLC-DAD-ESI-MSn. J. Agric. Food Chem. 58, 4681-4692. DOI: 10.1021/jf904211q.

A. K. Sandhu L Gu 2010Antioxidant capacity, phenolic content, and profiling of phenolic compounds in the seeds, skin, and pulp of Vitis rotundifolia (Muscadine grapes) as determined by HPLC-DAD-ESI-MSnJ. Agric. Food Chem58,4681469210.1021/jf904211q

24 

Sauceda, A. E. Q., Sáyago-Ayerdi, S. G., Ayala-Zavala, J. F., Wall-Medrano, A., de la Rosa, L. A. , González-Aguilar, G. A. &Álvarez-Parrilla, E . (2018). Biological Actions of Phenolic Compounds. En: Yahia, E. M. (Ed.) Fruit and Vegetable Phytochemicals: Chemistry and Human Health (pp. 286-307). Hoboken: John Wiley and Sons Ltd.

A. E. Q. Sauceda S. G. Sáyago-Ayerdi L. A. de la Rosa G. A González-Aguilar E Álvarez-Parrilla 2018Biological Actions of Phenolic Compounds E. M Yahia Fruit and Vegetable Phytochemicals: Chemistry and Human Health286307HobokenJohn Wiley and Sons Ltd

25 

Torres-Aguirre, G. A., Muñoz-Bernal, O. A., Álvarez-Parrilla, E ., Núñez-Gastélum, J. A., Wall-Medrano, A., Sáyago-Ayerdi, S. G. & de la Rosa, L. A. (2018). Optimización de la extracción e identificación de compuestos polifenólicos en anís (Pimpinella anisum), clavo (Syzygium aromaticum) y cilantro (Coriandrum sativum) mediante HPLC acoplado a espectrometría de masas. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas, 21, 103-115. DOI: 10.22201/fesz.23958723e.2018.2.4.

G. A Torres-Aguirre O. A Muñoz-Bernal E Álvarez-Parrilla J. A Núñez-Gastélum A Wall-Medrano S. G. Sáyago-Ayerdi L. A. de la Rosa 2018Optimización de la extracción e identificación de compuestos polifenólicos en anís (Pimpinella anisum), clavo (Syzygium aromaticum) y cilantro (Coriandrum sativum) mediante HPLC acoplado a espectrometría de masasTIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas21,10311510.22201/fesz.23958723e.2018.2.4



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TIP REVISTA ESPECIALIZADA EN CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS, Volumen 24, 2021, es una publicación editada por la Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria, Deleg. Coyoacán, C.P. 04510, Ciudad de México, México, a través de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Campus I, Av. Guelatao # 66, Col. Ejército de Oriente, Deleg. Iztapalapa, C.P. 09230, Ciudad de México, México, Teléfono: 55.56.23.05.27, http://tip.zaragoza.unam.mx, Correo electrónico revistatip@yahoo.com, Editor responsable: Dra. Martha Asunción Sánchez Rodríguez, Certificado de Reserva de Derechos al Uso Exclusivo del Título No. 04-2014-062612263300-203, ISSN impreso: 1405-888X, ISSN electrónico: 2395-8723, otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor, Responsable de la última actualización de este número Claudia Ahumada Ballesteros, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Av. Guelatao # 66, Col. Ejército de Oriente, Deleg. Iztapalapa, C.P. 09230, Ciudad de México, México, fecha de la última modificación, 4 de febrero de 2021.

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