Introducción
Los polifenoles, son metabolitos secundarios producidos por las plantas, con al menos un anillo aromático y uno o más grupos hidroxilo. Algunos de ellos son moléculas simples de bajo peso molecular, mientras que otros forman polímeros (Stavrou, Christou & Kapnissi-Christodoulou, 2018). Las frutas y vegetales son las principales fuentes de polifenoles. Los beneficios que el consumo de estos compuestos aportan a la salud están relacionados directamente con sus propiedades antioxidantes (Kabir et al., 2015). Diversos estudios han demostrado que poseen una gran capacidad para capturar radicales libres, que son los responsables del estrés oxidativo y ayudan en la prevención de diversas enfermedades crónico degenerativas como el cáncer, la ateroesclerosis, las enfermedades cardiovasculares y del sistema nervioso central (Khalifa, Zhu, Li, K & Li, 2018; Majidinia, Bishayeeb & Yousefic, 2019; Zhang, Qi & Mine, 2019).
Justicia spicigera Schltdl. es una planta endémica de México, conocida comúnmente como muicle o muitle. Es un arbusto de hoja perenne con flores tubulares de color naranja (Ortiz-Andrade et al., 2012). En la medicina tradicional mexicana, J. spicigera ha sido una de las plantas más utilizadas debido a sus múltiples propiedades curativas. Investigaciones científicas han reportado la presencia de diversos compuestos fenólicos en extractos de diversas partes de la planta, siendo el flavonoide kaempferitrina uno de los más abundantes. A este compuesto se le ha asociado con propiedades antidiabéticas (Ortiz-Andrade et al., 2012), antitumorales y actividad inmunomoduladora (Alonso-Castro et al., 2012; Fernández-Pomares et al., 2018), actividad ansiolítica (García-Ríos, Mora-Pérez, González-Torres, Carpio-Reyes & Soria-Fregozo, 2019) y anticonvulsivo (González-Trujano et al., 2017).
A diferencia de los métodos de extracción convencionales, la extracción asistida por ultrasonido es un método simple y de bajo costo, que permite disminuir el tiempo y consumo del disolvente, con un aumento en el rendimiento de extracción (Živković, Janković, Menković & Šavikin, 2019). La eficiencia de la extracción asistida por ultrasonido se debe a los efectos producidos por la cavitación acústica en el disolvente. Este efecto permite una mejor penetración del disolvente en la muestra y en consecuencia el mejoramiento de la transferencia de masa desde las membranas celulares (Da Porto, Porretto & Decorti, 2013).
La extracción es la etapa inicial en la obtención de compuestos bioactivos. Diversos factores, como el tiempo de extracción, temperatura, tipo de disolvente y relación sólido/líquido pueden afectar el rendimiento y la bioactividad de los compuestos (Liu, Luo,Wang & Yuan, 2019). En este sentido, es importante evaluar el efecto de estos factores mediante técnicas que permitan encontrar las condiciones ideales donde las pérdidas se minimicen. La metodología de superficie de respuesta (MSR) es una serie de técnicas matemáticas y estadísticas útiles en el modelado y el análisis de problemas en los que una respuesta de interés recibe la influencia de diversas variables y donde el objetivo es optimizar esta respuesta (Montgomery, 2005). Una de las principales ventajas de la MSR es el número reducido de experimentos necesarios para estudiar múltiples factores y sus interacciones (Cai, Chen, Yi & Zou, 2019). Aunque existen algunos reportes sobre la extracción y evaluación de la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos de la planta J. spicigera, no existe información relacionada con el efecto del disolvente y el tiempo de extracción en el rendimiento y actividad de los compuestos bioactivos.
En este sentido, el objetivo del presente trabajo fue elucidar mediante la MSR,el efecto de los factores antes mencionados en el contenido y actividad antioxidante de los compuestos fenólicos extraídos de las hojas de J. spicigera.
Materiales y métodos
Reactivos y materiales
El material vegetal se recolectó en la localidad de San Luis Huexotla, municipio de Texcoco de Mora, Estado de México (19°29′23″N, 98°53′37″O). Los reactivos Folin-Ciocalteu, 2,4,6-Tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ), 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), cloruro férrico hexahidratado, catequina, ácido gálico y trolox se adquirieron de Sigma-Aldrich (EUA). Los ácidos clorhídrico y acético, el carbonato de sodio y acetato de sodio se compraron de JT Baker (México). Los disolventes utilizados fueron grado técnico.
Preparación del material vegetal
El material vegetal fue llevado al laboratorio de Biomateriales del CICATA IPN-Unidad Legaria, donde fue lavado con agua corriente, sanitizado en una solución de hipoclorito de sodio al 1% y secado bajo condiciones de sombra y temperatura ambiente. Una vez secas, las hojas fueron separadas de los tallos y pulverizadas en un molino de discos (Modelo 148-2, The Bauer Bros Co., EUA). El polvo obtenido fue tamizado (100 mesh) y almacenado en bolsas de plástico previo a su análisis.
Extracción asistida por ultrasonido
La extracción asistida por ultrasonido se realizó en un baño ultrasónico Elma-TI-H-5 (Alemania). El material en polvo se mezcló con el disolvente, en una relación 1:20 (sólido/líquido). El disolvente de extracción se conformó de una mezcla de agua/etanol a distintas proporciones (Tabla I). La mezcla resultante se acidificó con ácido fórmico al 1% y se sometió a tratamiento ultrasónico a 25 kHz. Posteriormente, los extractos se centrifugaron (15 min a 1,750 rpm) y el sobrenadante se filtró y envasó. Los residuos se sometieron a una segunda extracción siguiendo las mismas condiciones experimentales. Finalmente, los sobrenadantes fueron mezclados y concentrados en un rotavapor (Yamato, RE500) para su posterior liofilización en un equipo Labconco (FreeZone 4.5 Liter).
Análisis fitoquímico preliminar
El análisis fitoquímico preliminar es una prueba cualitativa que indica la ausencia o presencia de los principales grupos de metabolitos presentes en un extracto vegetal. El análisis fitoquímico se realizó mediante métodos estándar (Takaidza, Mtunzi & Pillay, 2018) y tomando en cuenta las siguientes pruebas cualitativas preliminares: reactivos de Dragendorff y Mayer para alcaloides, la prueba de Shinoda para flavonoides, las pruebas de Liebermann-Burchard y Salkowski para esteroles y terpenos, la prueba de FeCl3 para taninos y la prueba de la agitación para saponinas.
Contenido fenólico total
El contenido fenólico total se calculó a partir de la capacidad de reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (Waterhouse, 2002), con ligeras modificaciones. Un volumen de muestra de 20 µL se adicionó a 1.4 mL de agua destilada, seguido de 100 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu (2N). La solución se dejó reposar por 3 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se adicionaron 300 µL de una solución de carbonato de sodio al 20 % (m/v) y 180 µL de agua destilada. Después de 100 min de reposo en la oscuridad, la absorbancia se determinó a una longitud de onda de 760 nm, utilizando un espectrofotómetro Multiskan Go (Thermo Fisher, Finlandia). Los resultados, para el ácido gálico, se expresaron en miligramos, equivalentes de ácido gálico, por gramo de materia seca (mg EAG / g MS).
Capacidad antioxidante (FRAP)
La capacidad antioxidante se determinó utilizando la prueba FRAP (ferric reduction antioxidant power). La determinación de FRAP está basada en la reducción del complejo Fe3+-TPTZ al complejo azulado Fe2+-TPTZ (Benzie & Strain, 1996). La solución FRAP se preparó mezclando 25 mL de buffer de acetato 300 mM (pH 3.6), 2.5 mL de solución TPTZ (0.01 M) y 2.5 mL de una solución de FeCl3·6H2O (0.02 M). La solución final se calentó a 37 °C por 4 min previo a su uso. Una alícuota de extracto de 100 µL (1.0 mg/mL) fue mezclada con 1,900 µL de solución FRAP. Se dejó reposar por 30 min en la oscuridad y la absorbancia se determinó a 593 nm. Los resultados se reportaron en micro moles equivalentes de trolox por cada 1,000 ppm (µM ET / 1000 ppm).
Capacidad secuestradora de radicales libres (DPPH)
La capacidad antiradical se cuantificó mediante el ensayo DPPH, siguiendo la metodología de Molyneux (2004), con algunas modificaciones. Una alícuota de 500 µL de extracto se mezcló con 125 µL Tris-HCl (0.1 M). A esta solución, se le agregaron 500 µL de solución DPPH (0.17 mg/mL). Después de 30 min de reposo en la oscuridad, la absorbancia se registró a 517 nm, empleando ácido ascórbico como control. El porcentaje de reducción del radical DPPH fue calculado usando la ecuación 1.
El EC50 se define como la cantidad necesaria de extracto para reducir la concentración del radical DPPH en un 50%. El valor de EC50 se calculó a partir de la gráfica del efecto de reducción del radical DPPH versus la concentración del extracto.
Diseño de experimentos y análisis estadístico
La extracción de los compuestos fenólicos de J. spicigera se realizó de acuerdo a lo establecido en un diseño experimental central compuesto, conformado de un factorial 2 K (donde K = 2), una serie de corridas axiales y 5 puntos centrales. Las variables independientes o variables de estudio y sus niveles de variación se muestran en la Tabla I. El contenido de fenoles totales, la capacidad reductora del hierro (FRAP) y la actividad antiradical (DPPH) fueron seleccionadas como variables respuesta. Todos los experimentos se realizaron de manera aleatoria y los datos analizados mediante la MSR fueron para obtener los modelos matemáticos (ecuación 2) que describen las interacciones entre las variables independientes y las variables respuesta. La significancia de los modelos (P < 0.05) se determinó mediante el ANOVA (prueba de F) y la influencia de los factores de estudio sobre las variables respuesta se observó a través de los gráficos de superficie de respuesta (Design Expert ver. 8, Stat-Ease Inc., EUA).
donde Y es la variable respuesta, b0 es el intercepto, bi, bii y bij son los coeficientes de regresión y Xi y Xj son las variables de estudio.
Los análisis de regresión lineal se realizaron para evaluar la correlación entre el contenido de fenoles totales versus la actividad antioxidante (FRAP) y la actividad antiradical (EC50).
Resultados y discusión
Perfil fitoquímico
El perfil fitoquímico de los extractos crudos, acuosos y etanólicos de J. Spicigera (Tabla II) reveló la presencia importante de metabolitos secundarios como los flavonoides, esteroles y triterpenos. Por otra parte, los taninos y saponinas se identificaron en el extracto acuoso y etanólico, respectivamente. Estos resultados concuerdan con lo reportado previamente por García-Ríos et al. (2019).
Contenido fenólico total
Con la finalidad de predecir la influencia de las variables de extracción en el contenido fenólico total, los resultados obtenidos (Tabla III) fueron analizados mediante la MSR. Una gráfica de superficie nos da una interpretación visual de las interacciones entre dos variables evaluadas y la relación entre la respuesta y los niveles experimentales de cada variable. De acuerdo con la Figura 1, el contenido fenólico total tendió a aumentar a medida que la concentración de agua en la mezcla del disolvente fue menor, independientemente del tiempo de extracción. Esto permite inferir que la mayoría de los compuestos fenólicos presentes en las hojas de muicle presentan una polaridad moderada al favorecerse su extracción cuando el etanol predomina en la mezcla de extracción. De acuerdo con Kelly, Kelly & O’ Mahony (2019), los polifenoles presentan generalmente baja solubilidad en el agua, debido a su naturaleza química, mientras que son solubles preferentemente en disolventes de menor polaridad. Los resultados de esta investigación concuerdan con lo reportado por Mkaouar, Bahloul, Gelicus, Allaf & Kechaou (2015), quienes señalan que los polifenoles de la hoja del olivo presentan una mayor afinidad con el etanol como disolvente de extracción.
Tabla III
Diseño experimental y resultados de las variables de estudio.
Figura 1
Superficie de respuesta mostrando el efecto de las variables de extracción en el contenido fenólico total.
La ecuación 3 representa el modelo matemático para la variable contenido de fenoles totales (Y1). Este modelo presentó un buen ajuste a los datos experimentales (R2 = 0.8359). Sin embargo, el ANOVA evidenció que solamente la variable X1 (concentración de agua) fue estadísticamente significativa (P < 0.001).
Capacidad reductora del hierro (FRAP)
La capacidad reductora del hierro es considerada como la habilidad de un antioxidante natural para donar electrones (Wang, Huang, Shao, Qian & Xu, 2012). La Figura 2 muestra el efecto de las condiciones de extracción en la capacidad reductora del hierro de los extractos de J. spicigera. Es posible observar que la capacidad reductora del hierro tiende a incrementarse cuando la concentración de agua en la mezcla del disolvente disminuye, observándose una ligera alza al aumentar el tiempo de extracción. Sin embargo, de acuerdo con el ANOVA, la variable tiempo no fue estadísticamente significativa (P > 0.05). La Figura 3 muestra una correlación positiva, pero moderada entre el contenido de fenoles totales y la capacidad reductora del hierro (r = 0.81), lo que indica que aunque los compuestos fenólicos fueron en su mayoría los responsables de la actividad, también otros compuestos de naturaleza no fenólica, presentes en los extractos, contribuyeron con el poder antioxidante. Es muy probable que entre estos compuestos se encuentre el ácido ascórbico (vitamina C), ya que es un constituyente esencial que se encuentra prácticamente en todas las especies vegetales (Davey et al., 2000). De acuerdo con Paciolla et al. (2019), el ácido ascórbico puede actuar como un potente agente reductor, por lo que tiene la capacidad de reducir el hierro, de la forma férrica (Fe3+) a la ferrosa (Fe2+).
Figura 2
Superficie de respuesta mostrando el efecto de las variables de extracción en la actividad antioxidante (FRAP).
El modelo que define a la variable FRAP mostró un buen ajuste a los datos experimentales (R2 = 0.9285). El término lineal y cuadrático de la variable concentración de agua, así como la interacción entre las dos variables fueron parámetros altamente significativos (P < 0.01). La ecuación 4 muestra el polinomio de segundo orden con los términos significativos de la capacidad reductora del hierro (Y2) del extracto de J. spicigera.
Capacidad antiradical (DPPH)
La actividad secuestradora de los radicales libres, medida mediante el EC50 de los extractos de J. spicigera, fue determinada a través de la técnica de DPPH. La Figura 4 muestra la relación entre la capacidad antiradical y las condiciones de extracción. Se puede apreciar que el valor de EC50 fue menor al disminuir la proporción de agua en la mezcla del disolvente, independientemente del tiempo de extracción. El EC50 está definido como la cantidad de extracto necesaria para disminuir la concentración inicial del radical DPPH en un 50 %. Entre menor sea el valor de EC50, mayor será la actividad de los extractos para actuar como secuestradores de radicales DPPH (Wootton-Beard, Moran & Ryan, 2011).
Figura 4
Superficie de respuesta mostrando el efecto de las variables de extracción en la capacidad inhibitoria de los radicales libres (EC50).
La Figura 5 muestra una correlación negativa y moderada (r = 0.82) entre la actividad antiradical y el contenido fenólico total de los extractos de J. spicigera. Este resultado indica que la actividad antiradical no se limitó a la presencia de compuestos fenólicos, también otras moléculas con la propiedad de actuar como agentes antiradicales contribuyeron a esa actividad. De manera similar a la capacidad antioxidante, la vitamina C pudo contribuir en la actividad antiradical de los extractos de J. spicigera, ya que una de las funciones biológicas del ácido ascórbico en plantas y otros organismos es la de actuar como secuestrador de radicales libres (Davey et al., 2000).
El modelo matemático que expresa la variable respuesta EC50 (Y3), mostró un ajuste importante a los datos experimentales (R2 = 0.9415). Aunque el modelo fue estadísticamente significativo, el ANOVA indicó que sólo los términos lineal y cuadrático de la variable concentración de agua fueron significativos (P < 0.05). La ecuación 5 muestra la ecuación polinomial cuadrática con los términos significativos que definen la capacidad antiradical de los extractos de J. spicigera.
Conclusiones
De J. spicigera fueron extraídos compuestos bioactivos con actividad antioxidante mediante extracción asistida por ultrasonido. El perfil fitoquímico evidenció principalmente la presencia de metabolitos secundarios como los flavonoides, esteroles y triterpenos. En el proceso de extracción, la relación agua/etanol fue el factor que afectó significativamente las variables de respuesta. La correlación entre el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante fue moderada, debida muy probablemente a la presencia de otros compuestos de naturaleza no fenólica que también contribuyeron con esta propiedad. De acuerdo con la MSR, las condiciones óptimas de extracción son una relación de 25/75 de agua/etanol como disolvente y un tiempo de sonicación de 16 min.
