Introducción
La guanábana (Annona muricata L.) es uno de los
cultivos con mayor importancia en algunas regiones tropicales del planeta (Mishra, Ahmad, Kumar & Sharma, 2013),
caracterizada por su pulpa con alto contenido de azúcares y compuestos bioactivos
promotores de la salud (Zorofchian et
al., 2015). Actualmente, el estado de Nayarit es considerado
como el principal productor de guanábana en México, al generar grandes expectativas
de crecimiento dentro del sector agrícola (SIAP,
2019), sin embargo, la alta susceptibilidad a infecciones fúngicas ha
sido una limitante para su comercialización a nivel nacional e internacional (Berumen-Varela, Hernández- Oñate, Tiznado-Hernández,
2019). Rhizopus stolonifer es un hongo filamentoso del
orden de los Mucorales identificado como el principal agente causal del deterioro
fúngico durante el periodo postcosecha del fruto de guanábana dentro del estado de
Nayarit (Ramos-Guerrerro et al.,
2018). Este tipo de enfermedades han sido relacionadas con una alta
dependencia al uso de fungicidas químicos, representando un grave riesgo para la
salud humana y el ambiente (Singh & Sharma,
2018). Debido a lo anterior, se ha buscado el desarrollo de alternativas
no contaminantes que permitan el control de estos fitopatógenos y que sean seguras
para el consumidor (González-Estrada et
al., 2020; Jiménez-Zurita
et al., 2017).
En la última década, el quitosano surgió como una opción potencial
para la prevención y el tratamiento de algunas de las principales enfermedades
fúngicas asociadas a frutos tropicales (Gutiérrez-Martínez et al., 2018). Este polisacárido
alcalino con propiedades fungicidas, filmogénicas e inductoras (Romanazzi, Feliziani & Sivakumar, 2018), es
obtenido a partir de la desacetilación parcial de la quitina presente en algunos
hongos y exoesqueletos de crustáceos mediante extracción química o enzimática (Betchem, Nana & Wang, 2019).
Anteriormente, se reportó la aplicación del quitosano grado reactivo con diferentes
pesos moleculares (1.74x104 - 3.07x104 Da) para la inhibición
del crecimiento micelial de R. stolonifer (30-99 %), destacándose
su elevado costo de aplicación y su limitada escalabilidad en campo (Hernández- Laurzado et al.,
2008; Ramos-Guerrero et
al., 2018). Aunque no existen suficientes estudios que
comparen la actividad antifúngica entre distintos productos y grados de pureza del
polímero (Feliziani et al.,
2013; Zhang et al. ,
2019), sin embargo, la aplicación del quitosano grado comercial ha
demostrado ser una alternativa económica y efectiva para la protección de los
productos agrícolas en postcosecha (Pagliarulo
et al., 2015; Xing
et al., 2018). De igual forma, la biocompatibilidad
del quitosano con otros antifúngicos naturales, como podrían ser los compuestos
bioactivos presentes en algunos extractos vegetales (Bajic et al., 2019; Siripatrawan & Harte, 2010), puede generar un mejor espectro de
acción antifúngico mediante la mejora de las propiedades funcionales del polímero,
así como una mayor estabilidad de los compuestos activos incorporados en su matriz
polimérica (Nallamuthu, Devi & Khanum,
2015; Singh & Sharma, 2018;
Woranuch, Yoksan & Akashi, 2014;
Xie, Hu, Wang & Zeng, 2014). El
aprovechamiento de los subproductos agrícolas como fuente de compuestos bioactivos
con potencial antifúngico puede representar una alternativa sustentable para el
control de las principales enfermedades fúngicas en frutos tropicales (Fiore & Cigic, 2019; Ribeiro-da Silva et al., 2014). En este
sentido, se han reportado la presencia del ácido clorogénico,
flavonoides, alcoholes y otros compuestos orgánicos derivados del metabolismo
secundario en plantas y en los extractos acuosos del mesocarpio del coco
(Cocos nucifera L.) (Aguilar-Méndez, Campos-Arias, Quiroz-Reyes & Ronquillo-de Jesús
2019; Cortés-Rivera, González-Estrada &
Blancas-Benítez, 2019a; Dey, Chakraborty
& Mitra, 2005). Estos compuestos bioactivos se han asociado
ampliamente con la capacidad de inhibir el desarrollo y la proliferación de algunos
patógenos fúngicos importantes como Botrytis cinerea, Penicillium expansum,
P. digitatum y R. stolonifer (Corato, Salimbeni, De Pretis, Avella & Patruno, 2017; Lagrouh, Dakka & Bakri, 2017). En un
estudio reciente, se reportó la reducción del desarrollo micelial de P.
italicum en un 80 %, así como la disminución en la
esporulación en un 98 % y la germinación de esporas en un 99 % mediante la
aplicación del extracto acuoso del mesocarpio del coco in vitro
(Cortés- Rivera, Blancas-Benítez, Romero-Islas,
Gutiérrez-Martínez & González-Estrada, 2019b). El objetivo del
presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto antifúngico del quitosano y
los extractos acuosos del mesocarpio de C. nucifera aplicados
individualmente y en combinación sobre el desarrollo in vitro de
R. stolonifer.
Materiales y métodos
Materia prima
El mesocarpio del coco (Cocos nucifera L. var. Criollo) fue
adquirido en la ciudad de San Blas, Nayarit, México (21°32′23″N 105°17′08″O) con
productores locales; seleccionando muestras con madurez de consumo y sin
presencia de daños durante la cosecha. Las muestras se procesaron en polvo fino
de acuerdo con el procedimiento descrito por Cortés-Rivera et al. (2019a). Se usó quitosano
comercial (PM = > 3.01 x 104 Da, cp = 200, 90 % de desacetilación, América
Alimentos S.A. de C.V., Zapopan, Jalisco, México) para los ensayos.
Preparación del extracto acuoso y soluciones de quitosano
Las extracciones acuosas del mesocarpio se llevaron a cabo mediante el método
propuesto por Cortés-Rivera et
al., (2019a) con algunas modificaciones, 500 mg de
mesocarpio en polvo se añadieron en 25 mL de agua destilada estéril y se mantuvo
bajo agitación constante a 300 rpm durante 1 h, el extracto se centrifugó
(Hermle Z326 K, EE. UU.) a 6,000 rpm, durante 10 minutos a 4 oC y se
recuperaron los sobrenadantes.
Los extractos obtenidos se filtraron usando un filtro de jeringa estéril (Unidad
de filtro Millex-HN; 0,45 µm de diámetro de poro) y las soluciones se
almacenaron en tubos estériles a 4 ºC. Las soluciones de QC se prepararon en
concentraciones de 0.5, 1.0 y 1.5 % (p/v) empleando una solución de vinagre
blanco como disolvente y 7% de ácido acético (Member’s Mark, México) al 10 %
(v/v), las soluciones se sometieron a agitación constante durante 24 h, y el pH
se ajustó a 5.6 con una solución de NaOH 1 N, añadiendo 0.1 mL de Tween 80
(Sigma-Aldrich, MO, USA) como tensoactivo. Las interacciones consistieron en
mezclas detalladas a continuación: QC 0.5 % + EAC 1 %, QC 1 % + EAC 5 % y QC 1.5
% + EAC 10 %, las soluciones se esterilizaron por separado en autoclave durante
(15 min, a 121 oC, 15 PSI) posteriormente se mezclaron usando un vórtice (Vortex
Genie 2, Scientific Industries, EE. UU.) hasta obtener una mezcla homogénea.
Reactivación de Rhizopus stolonifer
R. stolonifer fue aislado de los tejidos de la guanábana
infectados e identificado por ensayo molecular mediante la amplificación de las
regiones ARNr 18s y 28s (Ramos- Guerrero
et al., 2018), posteriormente fue reactivado
agregando 40 µL de una suspensión de esporas (1x106 esporas/ mL) en cajas Petri
y en un medio enriquecido con guanábana, las cajas fueron incubadas a 25 ± 2 ºC
durante 8 días, el medio de cultivo se preparó mezclando 24 g de agar
bacteriológico (MCD LABMR) con 56 g de cáscara y pulpa de guanábana en madurez
de consumo por litro (L) de agua destilada estéril.
Inhibición del crecimiento micelial
Para la realización de esta prueba se cortaron discos de 10 mm de diámetro de
cultivos de R. stolonifer con 4 días de desarrollo y se
depositaron en cajas de Petri que contenían los tratamientos con diferentes
concentraciones de EAC (1, 5, 10 % v/v), QC (0.5, 1.0 y 1.5 % w/v) y las
combinaciones (QC 0.5 % + EAC 1 %, QC 1 % + EAC 5 % y QC 1.5 % + EAC 10 %). Las
cajas se incubaron a 25 ± 2 °C durante 2 días, las placas control (agar)
consistieron solo en agar enriquecido con guanábana. Se empleó un control
positivo utilizando un fungicida regional para el tratamiento de la guanábana,
Tiabendazol a 300 ppm (MERTECT® 340 F, ADAMA Ltd., México) y un control negativo
empleando vinagre al 10 % ajustado a un pH de 5.6 con NaOH 1N. Los resultados se
reportaron como porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en comparación
con el control (Agar).
Inhibición de la esporulación
El efecto de los tratamientos en el proceso de esporulación se evaluó usando las
cajas de Petri como el medio en donde se midió el crecimiento del micelio, se
añadieron 10 mL de agua destilada estéril, y se realizó una ruptura por
frotación del micelio usando una varilla de vidrio estéril para liberar las
esporas. La suspensión se filtró en una gasa estéril y la concentración de
esporas se determinó mediante un recuento microscópico utilizando un
hemocitómetro (Paul Marienfeld GmbH & Co., Alemania). Para cada tratamiento,
se realizaron 100 observaciones utilizando un microscopio óptico (Motic
Instruments Inc. BA300, Canadá). Los resultados se expresaron como número de
esporas/mL.
Germinación de las esporas
La germinación de las esporas se evaluó depositando 100 µL de una suspensión con
las esporas (1×105 esporas/ mL) en discos de medio de guanábana adicionados con
los tratamientos. Las muestras se incubaron a 25 ± 2 °C durante 4 h y se
observaron microscópicamente, se analizaron 100 esporas por disco. Las esporas
se consideran germinadas cuando el tubo germinal tiene al menos el doble del
diámetro de una espora (Ramos-Guerrero
et al., 2018). Los resultados se expresaron en
porcentajes.
Modelo de crecimiento
Se modeló el desarrollo radial de R. stolonifer sobre los
diferentes tratamientos utilizando los rangos de temperatura reportados para el
almacenamiento del fruto de guanábana. Se empleó el método descrito por Ochoa-Velasco, Navarro-
Cruz, Vera-López, Palou &
Avila-Sosa (2017) con algunas modificaciones utilizando cajas Petri
en un medio de cultivo de guanábana adicionado con las diferentes
concentraciones de los EAC, el QC y sus combinaciones. Las cajas Petri fueron
inoculadas en el centro con 100 µL de la suspensión con esporas
(1×105 esporas/mL) y se almacenaron a temperatura de
almacenamiento (25 ºC) y de refrigeración a 15 ºC. Se tomaron fotografías del
crecimiento radial en periodos de 2 horas y las capturas fueron binarizadas y
fraccionadas en imágenes de círculos concéntricos de crecimiento progresivo
hasta la colonización completa de la caja Petri. La cinética de crecimiento
radial fue ajustada con el Software Find Graph (UNIPIZ Lab, 1.960, EE. UU.)
ajustando las curvas a un modelo modificado de Gompertz mediante la siguiente
ecuación:
Donde:
N
t
= Crecimiento en el tiempo (t).
N
0 =Crecimiento en el tiempo (0).
V
máx
= Tasa de crecimiento máxima específica.
A = Crecimiento máximo en la fase estacionaria.
ƛ = Duración de la fase de latencia.
Los parámetros del modelo se estimaron mediante un análisis de regresión
utilizando el software Statistica 10.0 para Windows. El valor del error
cuadrático medio (MSE) y el coeficiente de determinación (R2) se
usaron para determinar la fiabilidad del ajuste del modelo.
Análisis estadístico
Se realizó un diseño unifactorial completamente al azar para determinar las
diferencias significativas entre los tratamientos utilizados de EAC, QC y las
combinaciones. Para las pruebas de inhibición del crecimiento micelial, modelado
de crecimiento y esporulación se utilizaron cinco cajas de Petri y cinco discos
de agar en las pruebas de germinación de las esporas. Los experimentos se
repitieron dos veces de manera independiente. El ANOVA (análisis de varianza) de
los datos se aplicó utilizando el software Statistica versión 10.0 para Windows.
Las diferencias entre las medias de los datos se compararon mediante la prueba
de Fisher LSD, las diferencias (p ≤ 0.05) se consideraron
significativas.
Resultados y discusión
Inhibición del crecimiento micelial
El crecimiento micelial de R. stolonifer fue significativamente
diferente (p ≤ 0.05) dependiendo del tipo de tratamiento
utilizado después de 2 días de incubación (Tabla
I). En comparación con el control (agar), todas las concentraciones
de los EAC tuvieron un efecto en la reducción del desarrollo micelial de
R. stolonifer (Figura
1). Se observó un mejor resultado a una concentración del 10 % (58.81
± 6.48 % de inhibición). Estudios previos evaluaron la actividad antifúngica, de
los extractos acuosos de diferentes subproductos agrícolas (hojas, tallos y
semillas), sobre el crecimiento micelial de R. stolonifer,
reportando una efectividad in vitro inferior al 10 % de
inhibición (Bautista- Baños, Hernández-López,
Díaz-Pérez & Cano-Ochoa, 2000; Medda, Hajra, Dey, Bose & Mondal, 2014), que podría estar
relacionada a diferencias en el perfil fitoquímico de los tejidos utilizados
para realizar la extracción (Aqil et
al., 2010), sugiriéndose además una mayor
susceptibilidad de R. stolonifer al interactuar con extractos
ricos en compuestos fenólicos, flavonoides, terpenos, alcoholes y alcaloides
(Bhagwat & Datar, 2014; Manenji, Mudyiwa, Midzi & Tsodzo, 2017;
Shreya, Hajra, Dey, Bose & Mondal,
2014; Yang & Jiang, 2015).
En este sentido, se reportó un alto contenido en ácidos hidroxicinámicos, ácido
clorogénico, galocatequina y algunos alcoholes de cadena corta relacionados con
la actividad antifúngica en los EAC (Aguilar-Méndez et al., 2019; Cortés-Rivera, 2019a; Dey
et al., 2005). Aunque el mecanismo de acción de
estas moléculas orgánicas no se encuentra totalmente esclarecido, el potencial
antifúngico de estos metabolitos secundarios se ha relacionado con la presencia
de anillos aromáticos y grupos reactivos capaces de interactuar con las
moléculas polares presentes en la membrana fúngica, produciendo su rápida
permeabilización y generando alteraciones a nivel intracelular relacionadas con
la inactivación de las enzimas del metabolismo basal y disrupción de la membrana
mitocondrial (Cerqueira, Barcellos, Machado,
Aires & Dummer, 2015; Martínez
et al., 2017; Mohamed, Saleh, Abdel-Farid & El-Naggar, 2016; Masih, Peter & Tripathi, 2014; Zaker, 2016).
Tabla I
Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial, esporulación y
germinación de las esporas de R. stolonifer
expuesto a diferentes tratamientos por 2 días a 25 ± 2 oC.
|
Tratamientos |
Inhibición del crecimiento micelial (%) |
Esporulación (esporas/mL) |
Inhibición de la germinación (%) |
|
Control |
0.0 ± 0.0a
|
2.85x106 ± 0.53a
|
0.0 ± 0.0a |
|
Vinagre 10 % |
0.0 ± 0.0a
|
2.73x106 ± 0.48a
|
0.0 ± 0.0a
|
|
Tiabendazol 300 ppm |
100.0 ± 0.04b
|
0.0 ± 0.0b
|
100.0 ± 0.01b |
|
EAC 1 % |
48.32 ± 6.77c
|
1.4x105 ± 0.97c
|
48.5 ± 6.53c
|
|
EAC 5 % |
51.13 ± 6.48c
|
0.85x105 ± 0.81c
|
66.33 ± 6.12d
|
|
EAC 10 % |
58.81 ± 6.48d
|
0.55x105 ± 0.6d
|
70.5 ± 2.16e
|
|
QC 0.5 % |
67.12 ± 7.45e
|
0.45x105 ± 0.64d
|
98.66 ± 1.75f
|
|
QC 1 % |
83.27 ±2.90f
|
0.35x105 ± 0.41e
|
99.33 ± 0.81f
|
|
QC 1.5 % |
87.77 ± 3.10g
|
0.2x105 ± 0.25f
|
99.66 ± 0.5f
|
|
QC 0.5 % + EAC 1 % |
79.44 ± 3.32f
|
0.15x105 ± 0.23f
|
99.66 ± 0.51f
|
|
QC 1 % + EAC 5 % |
91.10 ± 1.84g
|
0.1x105 ± 0.21f
|
99.83 ± 0.40f
|
|
QC 1.5 % +EAC 10 % |
94.68 ± 2.15h
|
0.05x105 ± 0.15f
|
99.83 ± 0.40f
|
Figura 1
Crecimiento micelial de R. stolonifer expuesto a
diferentes tratamientos durante 2 días a 25 ± 2 ºC.
No se observaron diferencias significativas (p < 0.05) entre
el control (Agar) y el control negativo (vinagre 10 %) descartando la actividad
antifúngica del vinagre. El QC a concentraciones del 1.5 % mostró mayor
inhibición (87.77 ± 3.10 %). Anteriormente, fue reportada la capacidad del
quitosano para interactuar con las membranas fúngicas de R.
stolonifer produciendo permeabilización y pérdida del contenido
celular (proteínas y aminoácidos), causando graves alteraciones bioquímicas y
morfológicas que dificultan el proceso de infección y desarrollo de las hifas
expuestas (García-Rincón et
al., 2010; Ghaouth, Arul,
Asselin & Benhamou, 1992; González-Estrada et al., 2020; Gutiérrez- Martínez et al.,
2018).
Previas investigaciones concluyen que la aplicación del quitosano de bajo peso
molecular (< 2.5x104 Da) puede producir un mayor efecto inhibitorio sobre el
desarrollo micelial de R. stolonifer (hasta 99%) a partir de
concentraciones del 1.5 % (Hernández-Lauzardo
et al., 2008; Ramos-Guerrero et al., 2018).
La efectividad del quitosano con base en el peso molecular se ha relacionado con
el número de cargas positivas capaces de interactuar de manera electrostática
con la pared del patógeno afianzando su actividad antifúngica (Romanazzi et al., 2018).
El quitosano de alto peso molecular tiene una menor presencia de grupos amino
disponibles en sus cadenas largas debido a posibles entrelazamientos que
explican su menor efectividad in vitro (Feliziani et al., 2013; Niaounakis, 2014). Los EAC y el QC no
demostraron ser completamente efectivos en aplicaciones individuales en
comparación con el control positivo (100 ± 0.0 % de inhibición), sin embargo, la
combinación del QC al 1.5 % con los EAC al 10 % resultó ser más efectiva (94.68
± 2.15 %). Se ha reportado el efecto aditivo o sinérgico de las propiedades
funcionales del quitosano al ser combinado con diferentes extractos vegetales
(Duran et al., 2016;
Khalifa, Barakat, El-Mansy & Soliman,
2017; Muzzalupo, Badolati,
Chiappetta, Picci & Muzzalupo, 2020; Sabaghi, Maghsoudlou, Khomeiri & Ziaiifar, 2015). Las
investigaciones realizadas mencionan una asociación estable del quitosano con
algunos compuestos fenólicos mediante interacciones hidrofóbicas, apilamiento
π-π, enlaces múltiples de hidrógeno o uniones covalentes entre los grupos
reactivos del quitosano y los grupos polares de los compuestos fenólicos (Siripatrawan & Harte, 2010; Xie et al., 2014; Jiao et al., 2019).
La aplicación de tratamientos que reduzcan o inhiban el rápido desarrollo
micelial de R. stolonifer puede ser una estrategia efectiva
para el control de las pudriciones blandas en frutos; así como también la
afectación de condiciones favorables para la captación de nutrientes se les
relaciona con una disminución en la patogenicidad de este hongo (Petrasch et al.,
2019).
Esporulación
La producción de esporas en R. stolonifer fue significativamente
diferente entre los tratamientos (p ≤ 0.05) después de 2 días de
incubación. En la Tabla I se muestra la
concentración de esporas por tratamiento. No se encontró diferencia significativa
(p > 0.05) entre el control (agar) y el control negativo
(vinagre 10 %). Los tratamientos de EAC y QC aplicados individualmente demostraron
ser efectivos con valores superiores al 90 % de inhibición. En estudios previos se
observó que la aplicación de los extractos acuosos ricos en ácidos fenólicos puede
tener un mayor efecto sobre los procesos de esporulación en R.
stolonifer (Bautista-Baños et
al., 2000; Bautista-Baños,
Hernández-López & Bosquez- Molina, 2004). Esto puede
deberse a un posible daño estructural en las membranas celulares, así como
alteraciones en la actividad enzimática relacionada con los procesos de adaptación y
diferenciación de las estructuras formadoras de esporas (Karim et al., 2015; Mohamed et al., 2016).
De igual forma, se observó una reducción similar en la capacidad de producción de las
esporas de R. stolonifer (< 99 %) al entrar en contacto con el
quitosano de alto peso molecular a partir de concentraciones de 0.5 % (García- Rincón et al., 2010).
Esto puede ser por la capacidad del quitosano para producir desequilibrios en la
homeostasis iónica del Ca2+ y K+ en la célula fúngica, produciendo el escape de los
nucleótidos, fosfatos, sustratos de reacciones enzimáticas relacionados con la
respiración, los procesos de diferenciación, así como a la producción de esporas
(Bautista- Baños, Ventura-Aguilar, Correa-Pacheco
& Corona-Rangel, 2017; Peña, Sánchez
& Calahorra, 2013).
No se observaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre las
combinacionesdelos EACconel QCdemostrandoserefectivas respecto al control positivo.
La aplicación de tratamientos que permitan la inhibición de los procesos de
esporulación en hongos filamentosos, es una estrategia importante en la ruptura del
ciclo de infección de los patógenos fúngicos (Hee-
Soo & Jae-Hyuk, 2012), en este sentido, la aplicación del QC y los
EAC puede ayudar a reducir la virulencia de R. stolonifer sobre
frutos susceptibles a su ataque.
Germinación de las esporas
El porcentaje de germinación de las esporas en R. stolonifer fue
significativamente diferente entre las concentraciones de los EAC
(p ≤ 0.05) después de 4 h de incubación (Tabla I) y la concentración del 10 % de EAC
resulto ser más efectiva (70.5 ± 2.16 % de inhibición). El proceso de
germinación de las esporas es un evento importante para la infección por hongos,
los extractos acuosos ricos en compuestos fenólicos como el ácido clorogénico
podrían inducir a una mayor inhibición de los mecanismos de germinación, al
suprimir la transducción de señales relacionada con la actividad enzimática de
las esporas (Karim et al.,
2015; Mohamed et
al., 2016).
Todos los tratamientos con QC fueron más efectivos para inhibir el proceso de
germinación de las esporas (≥ 98.66 ± 1.75 % de inhibición). Se conoce un patrón
entre el peso molecular del quitosano y su efecto sobre los procesos de
germinación de las esporas en algunos hongos filamentosos, por consiguiente la
aplicación del quitosano de alto peso molecular demostró mejores resultados
contra R. stolonifer (García-Rincón et al., 2010; Ramos-Guerrero et al., 2018). Esta mayor
inhibición se relaciona con la capacidad que tienen los grupos amino (-NH2)+
presentes en las moléculas del quitosano para interactuar con las cargas
negativas de la membrana celular de la espora, causando cambios en su
permeabilidad y alteraciones a nivel intracelular dificultando el proceso de
germinación (González-Estrada et
al., 2020). No se observaron diferencias significativas
(p ≤ 0.05) entre las combinaciones del extracto acuoso con
el quitosano.
La germinación de las esporas es considerada como la etapa más importante en la
infección y propagación de un patógeno fúngico (Cortés-Rivera et al., 2019b), la inhibición de este
proceso puede representar un daño importante sobre los mecanismos y estrategias
de proliferación de R. stolonifer.
Modelo de crecimiento
La ecuación modificada de Gompertz mostró un buen ajuste en la descripción del
desarrollo micelial de R. stolonifer sobre los diferentes
tratamientos, observándose un coeficiente de determinación promedio
(R2) de 0.997 ± 0.005 para ambas temperaturas de almacenamiento
(15 oC/25 oC). Debido a que R. stolonifer
presenta un crecimiento lineal a partir de 40 µm de longitud del tubo germinal,
este modelo matemático puede determinar de manera adecuada las principales
variables involucradas en la cinética de desarrollo de este patógeno (Nikkhah,
Hashemi, Habibi & Farhoosh, 2017; Pitt & Hocking, 2009). El análisis
estadístico demostró diferencias significativas (p ≤ 0.05)
entre las variables de velocidad máxima (V
máx
) y el periodo de latencia (ƛ) dependiendo del tipo de tratamiento
aplicado (Tabla II). Las concentraciones
más altas de los EAC (10 %) y el QC (1.5 %) produjeron un mayor aumento sobre la
fase de latencia (ƛ) del patógeno, así como una mayor reducción en la tasa de
crecimiento máximo (V
máx
:); sin embargo, los tratamientos combinados de los EAC con el
QC demostraron ser más efectivos al reducir estos parámetros al mínimo en ambas
temperaturas de almacenamiento.
Tabla II
Parámetros modificados del modelo de Gompertz para curvas de
crecimiento de R. stolonifer expuesto a diferentes
tratamientos y temperaturas.
|
Tratamientos
|
Parámetros de Gompertz
|
|
Vmáx
(mm/h)
|
ƛ (h)
|
Variabilidad (R2 adj.)
|
|
15 oC
|
25 oC
|
15 oC
|
25 oC
|
15 oC
|
25 oC
|
|
Control |
0.067 ± 0.02a
|
0.266 ± 0.09a
|
1.271 ± 0.42a
|
0.022 ± 0.01a
|
0.991 |
0.994 |
|
QC 0.5 % |
0.060 ± 0.01b
|
0.230 ± 0.05c
|
2.620 ± 0.61b
|
0.825 ± 0.06b
|
0.997 |
0.986 |
|
QC 1 % |
0.057 ± 0.01b
|
0.218 ± 0.04d
|
2.818 ± 0.74c
|
1.025 ± 0.09c
|
0.996 |
0.981 |
|
QC 1.5 % |
0.056 ± 0.01c
|
0.212 ± 0.02d
|
3.002 ± 0.83c
|
1.193 ± 0.14c
|
0.997 |
0.984 |
|
EAC 1 % |
0.063 ± 0.02b
|
0.245 ± 0.07b
|
2.069 ± 0.64b
|
0.692 ± 0.11b
|
0.995 |
0.991 |
|
EAC 5 % |
0.062 ± 0.02c
|
0.239 ± 0.06b
|
2.525 ± 0.41b
|
0.766 ± 0.21b
|
0.996 |
0.990 |
|
EAC 10 % |
0.060 ± 0.01c
|
0.228 ± 0.05c
|
2.546 ± 0.31b
|
0.954 ± 0.18b
|
0.988 |
0.988 |
|
QC 0.5 % + EAC 1 % |
0.057 ± 0.02c
|
0.226 ± 0.09c
|
2.640 ± 0.38c
|
1.401 ± 0.23c
|
0.996 |
0.983 |
|
QC 1 % + EAC 5 % |
0.056 ± 0.01d
|
0.217 ± 0.04d
|
2.916 ± 0.42c
|
1.945 ± 0.28d
|
0.996 |
0.986 |
|
QC 1.5 % +EAC 10 % |
0.054 ± 0.01e
|
0.202 ± 0.01e
|
3.020 ± 0.78c
|
2.272 ± 0.33d
|
0.998 |
0.982 |
Existen pocos informes que describan el efecto de los antifúngicos orgánicos
mediante modelos matemáticos, pero se conoce que la aplicación de activos
naturales de manera combinada produce un mayor rango de acción sobre R.
stolonifer al modificar los principales parámetros cinéticos
asociados con su desarrollo micelial (ƛ,V
máx
) (Ochoa-Velasco et al.,
2017). Aunque los mecanismos asociados con la adaptación y el
desarrollo de R. stolonifer al interactuar con los
compuestosfenólicosnoseencuentrantotalmenteesclarecidos, estos podrían implicar
afecciones sobre los mecanismos de transporte y/o cambios en los mecanismos
celulares que conducen a la incorporación de proteínas y polisacáridos en la
zona de extensión de la hifa (Suwanamornler,
Sangchote, Chinsirikul, Sane & Chonhenchob, 2018). De igual
forma, se sabe de la capacidad del quitosano para afectar variables como la tasa
de crecimiento máxima de R. stolonifer, así como prolongar la
fase de latencia (ƛ), debido a modificaciones en el plasma celular y
alteraciones graves en la membrana, que conducen a un aumento en los periodos de
adaptación y diferenciación del patógeno (Hernández-Lauzardo et al., 2008; García-Rincón et al.,
2010).
La temperatura influyó en mayor medida sobre la dinámica de crecimiento de
R. stolonifer, sin embargo, todos los tratamientos
aplazaron la curva de desarrollo del patógeno (Figura 2), esta adaptación a temperaturas bajas y presencia de
compuestos antifúngicos se podría deber a características morfológicas y
estructurales como la presencia de hifas cenocíticas carentes de septos, capaces
de permitir una translocación rápida de organelos y una mayor absorción de
nutrientes, permitiendo el desarrollo de R. stolonifer en
condiciones de estrés (Pitt & Hocking,
2009; Sardella, Gatt &
Valdramidis, 2018). Los parámetros de crecimiento determinan el valor
de su utilidad al evaluar la actividad antifúngica del QC y los EAC sobre los
procesos de infección de R. stolonifer en frutos de
guanábana.
Figura 2
Cinética de crecimiento de R. stolonifer. A)
Dinámica de crecimiento a 15 ºC. B) Dinámica de crecimiento a 25 ºC.
N = Diámetro promedio de la colonia en el tiempo h, N0 = Diámetro de
la colonia en el tiempo 0.
Conclusiones
La combinación de los EAC con el QC produce un mayor efecto inhibitorio sobre el
crecimiento micelial, esporulación y germinación de las esporas en R.
stolonifer, así como una mayor modificación en los parámetros cinéticos
de crecimiento Vmáx y ƛ. Todos los tratamientos producen un efecto fungistático
sobre R. stolonifer y las combinaciones de los tratamientos
muestran un comportamiento sinérgico de manera in vitro, que pueden
utilizarse en futuras evaluaciones contra la pudrición suave en la guanábana
(A. muricata) y como una alternativa ecológica para la
reducción de la patogenicidad y la virulencia de R. stolonifer.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la
beca otorgada (731233) a Héctor Javier Cortés Rivera.
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TIP REVISTA ESPECIALIZADA EN CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS, Volumen 26, 2023, es una publicación editada por la Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria, Deleg. Coyoacán, C.P. 04510, Ciudad de México, México, a través de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Campus I, Av. Guelatao # 66, Col. Ejército de Oriente, Deleg. Iztapalapa, C.P. 09230, Ciudad de México, México, Teléfono: 55.56.23.05.27, http://tip.zaragoza.unam.mx, Correo electrónico revistatip@yahoo.com, Editor responsable: Dra. Martha Asunción Sánchez Rodríguez, Certificado de Reserva de Derechos al Uso Exclusivo del Título No. 04-2014-062612263300-203, ISSN impreso: 1405-888X, ISSN electrónico: 2395-8723, otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor, Responsable de la última actualización de este número Claudia Ahumada Ballesteros, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Av. Guelatao # 66, Col. Ejército de Oriente, Deleg. Iztapalapa, C.P. 09230, Ciudad de México, México, fecha de la última modificación, 27 de febrero de 2023.
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