Introducción
Debido a la creciente resistencia que han desarrollado algunos microorganismos a las sustancias utilizadas normalmente para combatirlos o controlarlos (Abdallah, 2011; Kisangau et al., 2007; Rai et al., 2014), se ve la necesidad de encontrar compuestos con nuevos mecanismos de acción (Duke et al., 2011). Al mismo tiempo, se ha observado también un desarrollo de multirresistencia a fármacos utilizados comúnmente en terapias anticancerígenas y antitumorales (Hohmann et al., 2002; Qiu et al., 2014; Zupko et al., 2009). Las plantas son una buena fuente de sustancias químicas con diferentes grados de complejidad estructural, que pueden utilizarse para encontrar sustancias con mecanismos de acción diferentes a las actuales (Koivunen et al., 2013).
Los metabolitos secundarios de las plantas, los cuales desempeñan un papel central en la interacción de la planta con su entorno (Dudareva et al., 2004; Verpoorte et al., 1999), pueden ser utilizados para controlar organismos de importancia, tanto en el área de la salud humana como en la agricultura (Jbilou et al., 2006; Moussaid et al., 2014; Mann & Kaufman, 2012). Estos compuestos son más seguros que los sintetizados químicamente en virtud de su biodegradación ambiental y baja toxicidad para los humanos y otros mamíferos (Mann & Kaufman, 2012).
Diferentes especies de la Familia Amaryllidaceae han sido utilizadas en la medicina tradicional de varios países. Los alcaloides son los principales metabolitos secundarios aislados de esta familia (Bastida et al., 2011) en cuyos géneros las actividades biológicas observadas se atribuyen a su presencia (Bastida et al., 2011; Cabezas et al., 2007; Tapia-Campos et al., 2012; Zupko et al., 2009). Así también, la actividad tóxica frente a organismos como Artemia salina, es atribuible a la presencia de alcaloides, saponinas, compuestos fenólicos y glucósidos cardiotónicos en los extractos y fracciones de las especies vegetales (Aziz et al., 2014; Nikolova & Tsvetkova, 2008; Olaleye, 2007).
Sprekelia formosissima (L.) Herbert forma parte del grupo de las plantas bulbosas ornamentales más hermosas de México empleada en la medicina tradicional mexicana (BDMTM, 2009; Leszczyñska-Borys et al., 1995). Es una planta silvestre de consistencia herbácea que pertenece a la Familia Amaryllidaceae, de nombre común lirio azteca. Está ampliamente distribuida en el territorio nacional, incluyendo las áreas montañosas de Chiapas, Chihuahua, Ciudad de México, Durango, Guerrero, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Estado de México, Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Veracruz y en Guatemala (Espejo-Serna & López-Ferrari, 2003).
Se ha reportado el aislamiento, caracterización y evaluación biológica de 7 alcaloides del extracto metanólico de bulbos de S. formosissima y son: hemantamina, tazetina, hemantidina, ismina, pretazetina, 2-epimacronina y 8-O-demetilmaritidina (Hohmann et al., 2002). Estos alcaloides presentan potencial para su utilización como tratamiento para el Alzheimer, así como contra células de cáncer de linfoma humano y células de linfoma de ratón MDR1 (Hohmann et al., 2002; Zupko et al., 2009). Por otro lado, en la medicina tradicional mexicana se utiliza la flor y raíz de Sprekelia para la curación de los jiotes y granos, mordeduras de víbora (BDMTM, 2009) y para el control de la pérdida de cabello (Sánchez, 1969).
En este trabajo se evaluaron las actividades antimicrobianas, de inhibición de la germinación e insecticida del extracto clorofórmico de S. formosissima (L.) Herbert.
Materiales y métodos
Material vegetal
Los bulbos frescos de S. formosissima fueron donados, cultivados e identificados por la Mtra. Edith Salomé en el Centro de investigación en plantas nativas (CIPNA) de la Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla.
Cepas microbianas
Las pruebas de inhibición microbiológica se realizaron en cepas de Escherichia coli (ATCC® 11775) y Staphylococcus aureus (ATCC® 25923), de la colección de la Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla, así como de Pseudomonas aeruginosa (ATCC® 27853) y Candida albicans (ATCC® 11006), obtenidas del cepario del Laboratorio de Microbiología de la Universidad de las Américas Puebla.
Medios de Cultivo
Se emplearon los medios de cultivo Müeller-Hinton (Beckton DickinsonTM, USA), agar MacConkey (BDTM, USA), agar Sal y Manitol (BDTM, USA), y agar Saboraud (BDTM, USA).
Controles positivos
Como controles positivos se utilizaron los antibióticos amoxicilina (Bio-Rad®, Francia), ofloxacina (Bio-Rad®, Francia), cefalexina (Bio-Rad®, Francia) y minociclina (Bio-Rad®, Francia).
Quistes de Artemia spp.
Se emplearon quistes de Artemia spp. (Azul, México), adquiridos en la tienda Petco Puebla (Puebla, Pue., México).
Semillas
Los ensayos se realizaron en semillas monocotiledóneas (Phalaris canariensis) y dicotiledóneas (Lactuca sativa), ambas de la marca Germinal MR adquiridas en la tienda Home Depot Puebla Angelópolis (Puebla, Pue., México).
Drosophila melanogaster
Se adquirieron adultos de Drosophila melanogaster en la tienda Petco Puebla (Puebla, Pue., México).
Preparación del extracto vegetal
Los bulbos (2,985 g) fueron rebanados y secados a la sombra; posteriormente, puestos en maceración con cloroformo durante tres días con agitación ocasional. El sobrenadante se filtró y evaporó en Rotavapor® (Büchi R-210, Suiza), obteniendo 11.4687 g (0.38%) del extracto clorofórmico (ECBSF).
Ensayos de actividad biológica
Se prepararon diluciones en un rango de concentraciones de 10 a 10,000 ppm del ECBSF en dimetilsulfóxido (DMSO) para la evaluación de su actividad biológica.
Ensayos de inhibición microbiológica
Las pruebas de inhibición microbiológica se realizaron con base en el método de Kirby-Bauer descrito por Bernal & Guzmán (1984). Las cepas se mantuvieron en cajas Petri con medio Müeller-Hinton para E. coli, agar MacConkey para P. aeruginosa, agar Sal y Manitol para S. aureus y agar Saboraud para C. albicans. Los crecimientos de 24 h de cada cepa se transfirieron asépticamente a tubos con 5 mL de solución salina estéril, hasta equiparar la turbidez del estándar 0.5 McFarland. Las cajas Petri con el medio de cultivo respectivo para cada organismo se prepararon de acuerdo con el manual del fabricante y se dejaron solidificar por 30 min.
Dentro de una campana de flujo laminar se depositaron 100 µL (microlitros) de cada tubo de solución inoculando en la superficie de las placas de agar, extendiendo la solución con la ayuda de un hisopo estéril. Se impregnaron discos de papel filtro también estéril (6 mm) con 6 concentraciones del ECBSF (100,000; 50,000; 20,000; 1,000; 100 y 10 ppm correspondiente a 1000, 500, 200, 10, 1 y 0.1 µg de ECBSF por disco, respectivamente). Los discos impregnados se colocaron sobre el agar con pinzas estériles evitando el movimiento para minimizar errores por difusión desigual. Adicionalmente, se utilizaron discos con los antibióticos de referencia amoxicilina 25 µg, ofloxacina 5 µg, cefalexina 30 µg y minociclina 30 µg como controles positivos, así como un control negativo con DMSO. Las placas se incubaron a 37°C por 24 h. Posteriormente, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se hicieron pruebas de comparación de medias por el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher a un 95% de confianza. Una zona de inhibición de 15 mm o más fue considerada como de alta actividad antimicrobiana (Mothana et al., 2009).
Ensayos de toxicidad
Para este ensayo se hicieron eclosionar quistes de Artemia spp. en agua marina artificial preparada con 30 g de sal marina comercial (Red Sea Fish Pharm, Israel) en un litro de agua destilada. Los quistes se incubaron a 25°C con fotoperiodo de 12 horas (Juárez et al., 2015). Con una pipeta Pasteur se transfirieron 10 nauplios de 24 h de nacidos a tubos de 10 mL por cada unidad experimental.
Debido a la baja solubilidad en el agua de las diferentes diluciones del extracto, se agregaron 15 µL de Tween 80 en la solución final de 5 mL. Los nauplios fueron expuestos a concentraciones de 1000, 500, 250, 100, 50, 30 y 10 ppm del ECBSF durante 24 h. Como control negativo se utilizó DMSO con Tween 80 en la misma proporción empleada en las muestras. La toxicidad fue estimada calculando la CL50 después del periodo de incubación. Los experimentos se realizaron por triplicado. Los nauplios se consideraron muertos al no detectar movimiento durante un periodo de 10 s de observación. La CL50 se calculó mediante análisis Probit (p= 0.05). El valor de la CL50 para el control fue de 936 ppm.
Ensayos de inhibición de la germinación y crecimiento radicular
Los ensayos se realizaron con base en el método reportado por Romano et al. (2011). Se depositaron 30 semillas de alpiste (Phalaris canariensis) y 30 semillas de lechuga (Lactuca sativa) en placas Petri con agar-agar al 1% (RBM Reactivos, México) preparado con 6 concentraciones finales del ECBSF (10, 50, 100, 250, 500 y 1000 ppm) y un testigo negativo preparado con DMSO. Los experimentos se realizaron por triplicado. Las semillas se dejaron en las placas Petri durante 14 días en condiciones de oscuridad a 25 °C y humedad del 50%. Al cabo de este tiempo, se midieron las longitudes de las raíces y se calculó el porcentaje de germinación en cada una de las unidades experimentales. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias por el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher a un 95% de confianza.
Ensayos de actividad insecticida
Los ejemplares de Drosophila melanogaster recién comprados se mantuvieron en condiciones de laboratorio a 25°C con fotoperiodo de 12 h, con una dieta a base de harina de maíz, levadura y agar-agar (RBM Reactivos, México). Para los ensayos se utilizaron adultos de la segunda generación, colocándolos por parejas (macho y hembra) en frascos limpios que contenían la dieta adicionada con 6 concentraciones finales del ECBSF (10, 50, 100, 250, 500 y 1000 ppm) y un control negativo preparado con DMSO. Las pruebas se realizaron por triplicado. Las moscas se mantuvieron en las mismas condiciones de laboratorio durante una generación (20 días). Una vez finalizado el periodo de tiempo se obtuvo el número de moscas totales y el número de moscas vivas. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias por el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher a un 95% de confianza.
Análisis estadístico
El análisis estadístico descriptivo de los ensayos de actividad biológica se realizó empleando el software Statgraphics Centurion XVI (Versión 16.2.04). Todos los valores fueron expresados como media ± error estándar de la media (S.E). Los datos de cada grupo fueron comparados utilizando análisis ANOVA de un factor. Un valor P <0.05 se consideró significativo.
Resultados
Ensayos de inhibición de raíz
Los resultados del análisis de varianza de las pruebas de inhibición de germinación de la semilla, junto con la comparación de medias, utilizando el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher a un 95% de confianza, se presentan en la Tabla I. La concentración a 1000 ppm tuvo un mayor efecto sobre la inhibición de la germinación. En el caso de las semillas de alpiste, con los 3 últimos tratamientos (250, 500 y 1000 ppm) también sucedió lo mismo que en el anterior, por otra parte, se comparó el porcentaje de germinación de la raíz entre los controles y los tratamientos (Figura 1) obteniéndose porcentajes de inhibición de la germinación bastante similares en la lechuga y el alpiste en la mayoría de los casos. Se observó una mejor inhibición de la germinación a concentraciones mayores a 250 ppm, con una inhibición del 98.6% a 1000 ppm en ambos casos.
Tabla I
ANOVA Resultados de actividad de inhibición de germinación de semillas.
Ensayo de actividad insecticida
Se analizó el promedio del número de moscas totales (vivas + muertas) para evaluar la inhibición de la reproducción, así como el número de moscas vivas para la evaluación de la actividad insecticida del extracto. Los análisis estadísticos obtenidos del análisis de varianza y la agrupación con el método LSD de Fisher con una confianza del 95%, se muestran en la Tabla II. Los resultados evidencian un efecto insecticida del extracto clorofórmico de bulbos de S. formosissima en la mosca de la fruta. La comparación de medias reveló un efecto significativo en el modelo a partir de la concentración de 50 ppm, con un efecto máximo a 1000 ppm en ambas variables (moscas totales y moscas vivas).
Adicionalmente, se observó que el promedio del número de moscas totales y vivas disminuyó significativamente a medida que aumentó la concentración del extracto. En la Figura 2, se grafican los porcentajes tanto de moscas vivas como los de moscas totales, evidenciando actividad del ECBSF tanto de inhibición de la reproducción como insecticida sobre Drosophila melanogaster.
Ensayos de inhibición microbiológica
En la Tabla III se muestran los resultados de las pruebas de actividad antibacteriana y fungicida del extracto clorofórmico de bulbos de S. formosissima, así como la comparación de medias de Fisher a un 95% de confianza. Se encontró evidencia de actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus a concentraciones de 50,000 ppm y 100,000 ppm (Tabla III), con zonas de inhibición de disco de 9.0 mm y 10 mm, respectivamente. El extracto también mostró actividad de inhibición contra E. coli, en donde la zona de inhibición más grande (6.6 mm) se obtuvo a una concentración de 100,000 ppm (Tabla III). Las especies P. aeruginosa y C. albicans mostraron resistencia al extracto.
Tabla II
ANOVA Ensayo de la actividad insecticida.
Ensayos de toxicidad
El valor de la concentración letal media CL50 (en un intervalo de confianza de 95%) para el extracto clorofórmico contra Artemia spp. fue de 46 ppm. El extracto se consideró como altamente tóxico para Artemia, de acuerdo a los rangos de toxicidad recomendados por el CYTED (1995), los cuales indican que el compuesto ensayado es altamente tóxico si presenta valores de CL50 entre 10 y 100 ppm.
Tabla III
Actividad antimicrobiana del ECBSF.
Discusión
Dentro de la Familia Amaryllidaceae, el alcaloide narciclasina, aislado de bulbos de Narcissus tazetta y también detectado en el género Sprekelia (Piozzi, et al., 1969), ha sido reportado con efectos en la germinación de las semillas de Arabidopsis, inhibiendo el ciclo mitótico de las células radiculares durante la germinación y el crecimiento de la raíz a concentración de 1.45 ppm (Na et al., 2011). Por otra parte, los alcaloides de quinolizidina de Lupinus albus L. (Fabaceae) inhiben el 100% de la germinación de Lactuca sativa L. (Wink, 1983). Por lo tanto, los efectos de inhibición de germinación y crecimiento de raíz obtenidos en los ensayos llevados a cabo con Lactuca sativa L. y Phalaris canariensis se relacionan con los alcaloides reportados y que, probablemente, se encuentran en el ECBSF a partir de los resultados obtenidos.
Los metabolitos aislados de ciertas especies vegetales tienen una importante actividad insecticida, afectando la supervivencia, crecimiento, desarrollo y el patrón de alimentación de los insectos fitófagos (Jbilou, et al., 2006; Moussaid, et al., 2014; Zapata, et al., 2014), en la Familia Amaryillidaceae, los extractos de alcaloides y saponinas totales de Narcissus broussonetii Lag. afectan significativamente la supervivencia de las etapas de desarrollo en la mosca blanca del tabaco (Bemisia tabaci) (Moussaid, et al., 2014), mientras que los extractos alcaloideos de bulbos de Phycella australis Ravenna tienen un efecto insecticida del 100%, además de disminuir significativamente la reproducción de Acyrthosiphon pisum Harris (pulgón de las leguminosas) (Castro-Gamboa, 2015). La presencia de alcaloides (Hohmann et al., 2002) en el extracto clorofórmico de bulbos de S. formosissima pueden explicar los efectos encontrados en el modelo ensayado.
Existen reportes de alcaloides del tipo aislado en S. formosissima (Hohmann et al., 2002) que poseen actividad antibacteriana (Qiu et al., 2014), al igual que extractos de otros géneros de la Familia Amaryllidaceae como, por ejemplo, la actividad antimicrobiana reportada para el extracto clorofórmico-metanólico de raíces y hojas de Hymenocallis littoralis (Jacq.) contra un panel de 12 microorganismos entre bacterias Gram (+), Gram (-) y hongos, donde se observaron halos de inhibición entre 15 y 29 mm (Noormi et al., 2012). Sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo reflejan que el ECBSF no inhibe significativamente el crecimiento de las cepas probadas; esta diferencia con los resultados reportados por Noormi et al. (2012) pueden deberse a varios factores, algunos de los más importantes pueden ser: i) diferencia en la técnica de extracción, ya que para este trabajo se utilizó la maceración con cloroformo, mientras que en el de Noormi et al. (2012) se usó una mezcla de cloroformo con metanol en una relación 3:1; ii) la cantidad de extracto por disco, ya que en el ensayo de difusión descrito en el trabajo de Noormi et al. (2012) se utilizaron 2000 µg de extracto por disco; mientras que en el presente estudio, la máxima concentración utilizada fue de 1000 µg de extracto por disco.
Algunos reportes atribuyen la toxicidad de especies de la Familia Amaryllidaceae frente a A. salina a la presencia de alcaloides, saponinas, compuestos fenólicos y glucósidos cardiotónicos en los extractos y fracciones de las especies vegetales (Aziz et al., 2014; Nikolova & Tsvetkova, 2008; Olaleye, 2007). De esta manera, la toxicidad del extracto observada en este trabajo, se puede atribuir a la presencia de alcaloides y saponinas.
Conclusiones
S. formosissima es una especie ampliamente utilizada en la medicina tradicional mexicana. Sin embargo, en este trabajo los resultados reflejaron que el ECBSF no inhibió significativamente el crecimiento de las cepas probadas. Por otra parte, este estudio muestra que el ECBSF posee actividad de inhibición de la germinación en las semillas monocotiledóneas y dicotiledóneas, así como actividad insecticida y de inhibición de la reproducción en la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). De esta manera, los resultados de este estudio sugieren que el extracto clorofórmico de bulbos de S. formosissima tiene potencial para su uso en desarrollo sustentable.
